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審判番号(事件番号) データベース 権利
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審決分類 審判 全部申し立て 2項進歩性  A61K
審判 全部申し立て 1項3号刊行物記載  A61K
管理番号 1002267
異議申立番号 異議1997-73380  
総通号数
発行国 日本国特許庁(JP) 
公報種別 特許決定公報 
発行日 1995-05-16 
種別 異議の決定 
異議申立日 1997-07-22 
確定日 1999-08-23 
異議申立件数
訂正明細書 有 
事件の表示 特許第2573467号「第IX因子タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物」の特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。 
結論 訂正を認める。 特許第2573467号の特許を維持する。 
理由 1.経緯
本件特許2573467号は、昭和59年3月2日に出願された特願昭59-38886号(優先権主張、1983年3月4日、米国)の一部を新たに分割した出願に係り、平成8年10月24日の設定登録後、特許異議申立がなされ、取消理由通知に対して、平成10年6月9日に訂正請求がなされたものである。
2.訂正請求について、
本件上記訂正請求に係る訂正事項は、以下のとおりである。
a.特許明細書の請求項1中の「カオトロピック試薬」を「リチウム塩」に訂正する。
b.請求項4及び7を削除し、請求項5及び6の項番をそれぞれ4及び5に、また、請求項8の項番を6に繰り上げる。
そして、a.の訂正は、「カオトロピック試薬」を特定の「リチウム塩」に限定するものであり、特許請求の範囲の減縮を目的とするものであるし、「カオトロピック試薬」として「リチウム塩」を使用することは、特許明細書の請求項4および7に記載されていたものであり、願書に添付された明細書に記載された事項の範囲内の訂正であることは明らかである。また、b.の訂正は、特許請求の範囲の請求項を削除するものであり、この訂正も特許請求の範囲の減縮を目的とし、願書に添付された明細書に記載された事項の範囲内の訂正である。
しかも、これらの訂正は、特許請求の範囲を実質的に、拡張、変更するものでもない。
さらに、後記することから明らかなように、本件訂正後の特許請求の範囲に記載された事項により特定される発明は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
したがって、本件訂正請求は、特許法第120条の4第2項及び同条第3項で準用する同法第126条第2-4項の規定に適合するので、該訂正を認める。
3.異議申立てについて、
本件訂正後の発明の要旨は、訂正明細書の記載からみて、それぞれ訂正明細書の請求項1に記載されたとおりの以下のものである。
「[請求項1](a).第IX因子タンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体を結合した粒子上に、前記第IX因子タンパク質と1種またはそれ以上の他のタンパク質との混合物からなる源物質から前記第IX因子タンパク質を吸着し、
(b)リチウム塩を含む緩衝水溶液を用いて、前記粒子から第IX因子タンパク質を欠いた現物質を除去し、さらに
(c)溶離液を用いて前記粒子から吸着した第IX因子タンパク質を溶離することにより、変性されておらず高い純度で濃縮されたかたちの活性な第IX因子タンパク質の組成物を回収する、各ステップを具備し、プロテアーゼインヒビターを添加することなく実行される方法により得ることができる、活性で高い純度で生成され濃縮されたかたちの第IX因子タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物。」
一方、本件異議申立人の主張の概要は、本件請求項1及び2の発明は甲第2号証に記載された発明であり、また、本件請求項3〜8に係る発明は甲第1号証および甲第4〜7号証に記載された発明から当業者が容易に発明できたものであるから、本件特許は、特許法第29条第1項または同条第2項の規定に違反してなされたものであるというものである。
証拠方法
甲第1号証:「生化学実験講座1タンパク質の化学I-分離精製」第5刷、株式会社東京化学同人、1981年3月31日、第313〜333頁
甲第2号証:「PROTIDES OF THE BIOLOGICAL FLUIDS Proceedings of The Thirtieth Colloquinm」(1982)第403〜407頁
甲第3号証:大英図書館の蔵する第2号証の表紙
甲第4号証:「蛋白質・酵素の基礎実験法」株式会社南江堂、1981年9月1日、第18〜24頁
甲第5号証:「凝固・腺溶・キニン」株式会社中外医学社、1979年8月10日、第84〜106頁
甲第6号証:特公昭48-3361号公報
そこで、本件異議申立人の主張について以下検討する。
甲第2号証においては、第IX因子に対するモノクローナル抗体を臭化シアン活性化シアン活性化セファロース2Bに固定化すること、該モノクローナル抗体固定カラムに第IX因子濃縮物を流すことにより第IX因子がモノクローナル抗体と結合したこと、この第IX因子が結合したモノクローナル抗体を緩衝化された生理食塩水および1Mの塩化ナトリウム水溶液で洗浄すること、さらに沃化力リ溶液で第IX因子を固定化モノクローナル抗体から溶離したことが記載されている。また、このように溶離された第IX因子は活性を保持しているとともに高度に精製されていること、及びクリスマス病患者の治療用途のために高純度第IX因子を大量に調製することを可能にする旨の記載があり、さらに、得られた第IX因子の分子量は59,000であることが記載されている。
しかしながら、この甲第2号証においては、第IX因子が結合したモノクローナル抗体を緩衝化された生理食塩水および1Mの塩化ナトリウム水溶液を用いて洗浄しているのに対して、本件訂正後の発明(以下、本件発明という。)においては、対応する工程において、リチウム塩を使用しているのであるから、両者における精製工程は異なる。
そして、精製方法が異なれば、得られる第IX因子も純度、活性等において同一であるとは直ちにはいえない。しかも、甲第2号証においては、上記甲第2号証の精製法により得られた第IX因子の分子量は59,000であることが示されている。一方、平成11年6月3日付上申書においては、本件特許出願に対応する米国特許5,614500号明細書の精製法(発明の詳細な説明中の精製法に関する記載は、本件訂正明細書と米国特許明細書とで異ならない。)を追試したルイス サマリア作成の宣誓書が添付されており、該宣誓書の試験によれば、リチウム塩の使用を含む上記米国特許明細書記載の精製法によって得られる第IX因子の分子量は、甲第2号証に示される分子量とは異なり、71,000であることが示されており、これらの点からみて、本件発明において薬剤成分として使用する第IX因子タンパク質と甲第2号証における第IX因子は同一のものとすることはできない。
してみれば、本件発明は甲第2号証に記載された発明とはいえない。
さらに、付言するに、特許異議申立人は、特許明細書の請求項4及び7におけるリチウム塩の使用について、さらに甲第4号証を提示し、リチウム塩の使用は甲第2号証および甲第4号証の記載から当業者において容易にできる旨主張している。
しかし、甲第4号証においては、カオトロピックイオンが、蛋白質の水に対する溶解度を高める旨記載され、カオトロピックイオンの性質の強さの順序は、陽イオンの場合、「Ba2+>・・・Li+>Cs+>Na+・・・(CH3)4N+」であると記載されており、リチウム塩もナトリウム塩もともにカオトロピック塩であることは伺われるが、甲第4号証においては、カオトロピックイオンを用いて第IX因子蛋白質吸着体から他のタンパクを除去することは記載されてはいないのであり、また、甲第2号証においては、第IX因子が結合したモノクローナル抗体を緩衝化された生理食塩水および1Mの塩化ナトリウム水溶液で洗浄することが記載されてはいるが、ここには、この洗浄液が甲第4号証に示されたカオトロピック性を利用するものであることも示されてはいないのである。してみれば、甲第4号証の記載を甲第2号証の記載と関連づけ、第IX因子の精製工程において甲第2号証の上記生理的食塩水等に代え、リチウム塩を使用することが当業者において容易にできるとすることは妥当ではない。しかも、このリチウム塩の使用を含む精製法によって得られる本件発明の薬剤成分である第IX因子は上記したように甲第2号証の第IX因子とは同じものとはいえず、さらに、甲第2号証及び甲第4号証においては、本件発明の第IX因子が得られることを予想し得る記載もないものであるから、これらの点からみれば、本件発明は、甲第2号証に加え甲第4号証の記載をみても、これらから当業者が容易に発明できたものではない。
そして、甲第1、5、6及び7号証は、リチウム塩の使用について記載のない請求項に対していわゆる進歩性を否定するために提示されたものであり、また、甲第3号証は、甲第2号証に係る刊行物が本件出願前に頒布されたものであることを立証するために提示されたものであって、これら甲各号証は、リチウム塩の使用を何等示唆するものでもなく、本件発明の薬剤成分を示唆するものではないから、甲第2および4号証に加えさらにこれら甲各号証の記載を検討しても、本件発明はこれら甲1〜7号証から当業者が容易に発明できたものとすることはできない。なお、訂正後の請求項2〜6はいずれも本件発明をさらに技術的に限定したものであるから、これら請求項の事項も当業者が容易に想到できたものとはいえない。
4.結び、
以上のとおりであるから、本件訂正請求は認めることができ、本件異議申立の理由及び証拠によっては本件特許を取り消すことができない。
また、他に本件特許を取り消すべき理由を発見しない。
よって、結論のとおり決定する。
 
発明の名称 (54)【発明の名称】
第IX因子タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】(a).第IX因子タンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体を結合した粒子上に、前記第IX因子タンパク質と1種またはそれ以上の他のタンパク質との混合物からなる源物質から前記第IX因子タンパク質を吸着し、
(b).リチウム塩を含む緩衝水溶液を用いて、前記粒子から前記第IX因子タンパク質を欠いた源物質を除去し、さらに、
(c).溶離液を用いて前記粒子から吸着した第IX因子タンパク質を溶離することにより、変性されておらず高い純度で濃縮されたかたちの活性な第IX因子タンパク質の組成物を回収する、各ステップを具備し、プロテアーゼインヒビターを添加することなしに実行される方法により得ることができる、活性で高い純度で精製され濃縮されたかたちの第IX因子タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物。
【請求項2】 前記源物質が血漿、血漿分画または血漿濃縮物であることを特徴とする請求項1に記載の薬剤的組成物。
【請求項3】 前記源物質が前記第IX因子タンパク質を生産するための遺伝子を含む細胞により発現されているものであることを特徴とする請求項1に記載の薬剤的組成物。
【請求項4】 4℃の条件下で前記方法を実行することによって得ることができる請求項1に記載の薬剤的組成物。
【請求項5】 キレート化剤を存在させて前記方法を実行することによって得ることができる請求項1に記載の薬剤的組成物。
【請求項6】 EDTAを存在させて前記方法を実行することによって得ることができる請求項1に記載の薬剤的組成物。
【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】
本発明は、第IX因子および他のビタミンK依存性タンパク質である第II因子、第VII因子、第X因子、プロトロンビン、プロテインC並びにプロテインSの分離および精製により得られる治療用途に適した薬剤的組成物に関する。特には、高純度タンパク質を血漿または濃縮物からクロマトグラフ吸着および濃縮技術により分離して得られる治療用途に適した薬剤的組成物に関する。
【0002】
【従来の技術】
血液凝固因子は正常な凝固機構において、生命の維持に必要な役割を果たしている。例えば、第IX因子欠乏症の患者は重大な出血問題を示している(血友病B)。従って、科学研究用だけでなく、治療に用いる量の第IX因子および他のビタミンK依存性タンパク質の単離を可能にすることが望まれていた。この目的に対して種々の方法が文献に記載されている。本発明に係る薬剤的組成物ないしタンパク質は、高純度でかつ高収率で得られ、特に他の血漿因子による汚染の比較的低い点において従来技術より優れているものである。さらに、多くの工程を必要とする従来技術では、時間がかかるのと全工程でのタンパク質の損失が避けられない。
【0003】
従来方法の一つとして、S.P.Bajaj等による「人間のプロトロンビン、第IX因子および第X因子の精製のための簡単化した処理方法」、Preparative Biochemisty,11(4),397〜412(1981年)がある。この方法では、血漿をクエン酸バリウムへの吸着およびそれからの溶離、硫酸アンモニウム分画、DEAE-セフアデックスクロマトグラフィー、そして、pH7.5のクエン酸ナトリウム緩衝液の中でのヘパリンーアガロースクロマトグラフィ-によってプロトロンビン、第X因子および第IX因子を分離するものである。第IX因子の報告された収率は、80〜220ユニット/mgの比活性で約35%であった。他の方法として、J.P.Miletich等による「硫酸塩化したデキストラン球体を用いての人間の血液凝固因子の第II.第IXおよび第Xの精製」、Methods in Enzymology,第80巻、頁221〜228に記載のものがある。この方法では、新鮮な冷凍血漿を解凍し、クエン酸バリウムにより沈澱、ジイソプロピルフルオロリン酸とトリス-塩酸中での再懸濁、硫酸アンモニウムによる沈澱、DE-52セルロースへのクロマトグラフィー、そして得られた分画の選択的な硫酸塩化したデキストラン球体への適用の手順で行うものである。第IX因子を含む分画の濃度は第V因子1wt%と同じ程度に不純物が混じっているとされている。B.Osterud等による「人間の血液凝固因子IX」、J.Biological Chemistry、253巻、No.17、頁5946〜5951(1978年)、では、第IX因子の精製を以下の手順、硫酸バリウムへの吸着およびそれからの溶離、DEAE-セルロースバツチクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、そしてヘパリンーアガロースのアフイニテイークロマトグラフで行っている。第IX因子活性は、207ユニット/mgであり、収率は記載されていない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
以上のことから、改良された方法で得られる活性で高い純度で精製され濃縮されたかたちのタンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物を提供することを目的としている。
【0005】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために本発明に係る活性で高い純度で精製され濃縮されたかたちのビタミンK依存性タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物は、(a).ビタミンK依存性タンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体を結合した粒子上に、前記ビタミンK依存性タンパク質と1種またはそれ以上の他のタンパク質との混合物からなる源物質から前記ビタミンK依存性タンパク質を吸着し、(b).カオトロピック試薬を含む緩衝水溶液を用いて、前記粒子から前記ビタミンK依存性タンパク質を欠いた源物質を除去し、さらに、(c).溶離液を用いて前記粒子から吸着したビタミンK依存性タンパク質を溶離することにより、変性されておらず高い純度で濃縮されたかたちの活性なビタミンK依存性タンパク質の組成物を回収する、各ステップを具備し、プロテアーゼインヒビターを添加することなしに実行される方法により得ることができるものであることを特徴とする。
【0006】
ここで、前記源物質が血漿、血漿分画または血漿濃縮であること、あるいは、前記ビタミンK依存性タンパク質を生産するための遺伝子を含む細胞により発現されたものであること、を特徴とすることができる。
【0007】
また、別の本発明に係る活性で高い純度で精製され濃縮されたかたちの第IX因子を含有する治療用途に適した薬剤的組成物は、(a).第IX因子に特異的なモノクローナル抗体に結合した吸着体粒子上に、前記第IX因子と1種またはそれ以上の他のタンパク質との混合物からなる源物質から前記第IX因子を吸着し、(b).カオトロピック試薬を含有する緩衝水溶液を用いて、前記吸着体粒子から前記第IX因子を欠いた源物質を除去し、さらに、(c).溶離液を用いて前記吸着体粒子から吸着した第IX因子を溶離することにより、変性されておらず高い純度で濃縮されたかたちの活性な第IX因子を回収する、各ステップを具備し、プロテアーゼインヒビターを添加することなしに実行される方法により得ることができるものであることを特徴としている。
【0008】
また、別の本発明に係る活性で高い純度で精製され濃縮されたかたちで得られるビタミンK依存性タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物は、(a).ビタミンK依存性タンパク質からなる群から選ばれるビタミンK依存性タンパク質に特異的なモノクローナル抗体に結合した吸着体粒子上に、前記ビタミンK依存性タンパク質と1種またはそれ以上の他のタンパク質との混合物である血漿、血漿分画または血漿濃縮の源物質から前記ビタミンK依存性タンパク質を吸着し、(b).塩化リチウムを含有する緩衝水溶液を用いて、前記吸着体粒子から前記ビタミンK依存性タンパク質を欠いた源物質を除去し、さらに、(c).溶離液を用いて前記吸着体粒子から吸着したビタミンK依存性タンパク質を溶離することにより、変性されておらず高い純度で濃縮されたかたちの活性なビタミンK依存性タンパク質の組成物を回収する、各ステップを具備し、4℃で、キレート化合物の存在下で、プロデアーゼインヒビターを添加することなしに実行される方法により得ることができるものであることを特徴とする。
【0009】
本発明によれば、タンパク質に特異的な抗体を用いての吸着操作でタンパク質を高度に精製されたかたちで得られる。
【0010】
上記構成において、ステップ(a)の段階は、血漿または濃縮物のような源物質からのタンパク質の免疫吸着を含む。ここで用いられる吸着体はタンパク質に特異的なモノクローナル抗体であり、そのモノクローナル抗体は適当な基質、例えばアガロース球体に結合されている。タンパク質を吸着した後、基質粒子を非吸着タンパク質を除去するために大量の緩衝溶液で洗浄する。吸着したタンパク質を溶液で処理し溶離させる。回収されたタンパク質は高純度、即ち不純物はほとんどなく、治療に用いることも更に精製することもできる。
【0011】
本発明に係るプロセスでは第IX因子の精製が1500倍の程度で得られ、これは従来技術を通じて大きな改良である。比活性は約34.8ユニット/mgであり、さらに第IX因子の収率はこの新規な方法において平均約50%、高くて約70%である。
【0012】
本発明は、ビタミンK依存性タンパク質として知られている第II因子、第VII因子、第IX因子、第V因子、プロトロンロビン、プロテインCおよびプロテインSのあらゆるタンパク質精製フォームにおける回収に容易に適用できる。血漿、血漿分画、血漿濃縮物が典型的な源物質として含まれる。タンパク質はまた、DNA組み換え技術、即ち、バクテリア、酵母または他の細胞の中へタンパク質を生産するための遺伝子を組み入れたタンパク質の混合物からも精製することができる。このような遺伝子組み込み技術は当該技術分野に通常の技術を有するものであれば公知のことであり、また、示されたタンパク質が1種またはそれ以上のタンパク質、細胞の残骸等の混合状態であることは理解される。
【0013】
【実施例】
以下の説明は、従来一つの操作で達成されるとは知られていなかった純度と濃度にまで第IX因子の分離と精製を達成するためになされ、用いられる本発明の具体例の詳細を提供するものである。この説明は、第IX因子の精製に適用される本発明の好適例であり、本発明を限定するものでなく、当該技術分野の領域内にある変化応用は本発明の範囲に属すると考えるべきである。その他のビタミンK依存性タンパク質は同様の操作により精製されるが、その操作は用いられる抗体を生じさせる第IX因子に代わる他のタンパク質を用いる範囲で改変される。
【0014】
A.第IX因子に対するモノクローナル抗体の調製
第IX因子に吸着するモノクローナル抗体は、続いて分離基質に結合されるが、そのモノクローナル抗体は種々の公開されている方法により高度に精製される第IX因子の調製することに始まる段階的手順により調製される。第IX因子の精製は血漿源から得られる物質を用いて達成されるが、純度が充分に高くないものは高濃度で用いられる。
【0015】
抗凝血性の正常な血漿の精製はOsterud等により示された方法、硫酸バリウムへの吸着および溶離、DEAE-セルロースバツチクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、そしてヘパリンーアガロースカラムによるアフイニテイークロマトグラフイーの順序で行なわれた。この方法による順序は、高度に精製された第IX因子を提供する。
【0016】
以下の手順に従って、血漿から得られた高度に精製された第IX因子をマウスに注射した。他の手順でも同様の効果を期待できる。第0日目、前記タンパク質100μgを0.05Mトリス、0.15M塩化ナトリウムを含むpH7.3の緩衝液0.1mlに溶解(または懸濁)させ、同容量のフロインドの完全アジュバントで振とうして調製した組成物をマウスの腹膜を通して注射した。第15日目、フロインドの完全アジュバントをフロインドの不完全アジュバントに代えた以外は同様のタンパク質56μgを再び注射した。第22、30、38および124日目、第15日目の注射を繰り返した。第239日目、マウスに精製した第IX因子のみを注射した。第243日目、マウスの牌臓を取り出し、定法に従って融合した。この方法はJ.P.Brown等による「モノクローナル抗体との免疫沈降反応により同定される正常および悪性の人細胞のタンパク質抗原」、JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,225巻、頁4980〜4983(1980年)に記載されている。この標準的手法は35%ポリエチレングリコール1000を50%ポリエチレングリコールに代える程度おいて変化させられる。
【0017】
陽性クローンは、正常人血漿の等量と各クロークからの上清液をインキュベートし、第IX因子活性を分析することにより同定される。クローンは、上清液が実質的に第IX因子凝血活性を中和したならば陽性と見なされる。クローンが陽性であると決定した後、それらは少なくとも2度サブクローン化し、第IX因子に対する抗体を生産する安定なクローンを得、少なくとも細胞の注入4日目に0.5mlのプリスタン(pristane)で腹膜を通じて前もって処理したBalb/cマウスの腹腔中に注射した。ハイブリドーマ細胞を牛の胎児の血清を含まないDelbeccoで修飾されたEagle媒質0.5mlにおいて、マウス1匹当り約5×106細胞の濃度になるように注射した。マウスの腹が膨れるのを確認して、腹水液をヘパリン中に約10ユニット/mlで集めた。多数のマウスからの腹水液は次のモノクローナル免疫グロブリン(IgG)の単離のために適当な容量に分けて貯蔵した。ヘパリン処理腹水液をすぐに使用しない場合には、-70℃で貯蔵し、使用直前に解凍するのがよい。腹水液からのIgGの最終収率は、腹水液100ml当たり約1gのIgGである。
【0018】
第IX囚子を精製する目的のためのモノクローナルIgGの特異性は、後述するようにモノクローナルIgGが分離基質体にカップリングすることにより、そして、分離基質に結合したIgGが血漿から第IX因子を除きその第IX因子が続くチオシアン酸ナトリウムを含む溶液で溶離されることを示すことにより評価される。
【0019】
モノクローナルIgGは、続く免疫吸着体を調整するのに用いられ、採取後すぐまたは貯蔵溶液の冷凍部分を解凍したヘパリン処理した腹水液から単離される。新鮮または凍結物に関わりなく使用され、溶液を4℃とし、等容量のリン酸緩衝液の塩溶液(PBS)で処理し、以下に示す組成物とする。希釈腹水を4℃で撹拌しながら等容量の飽和硫酸アンモニウム(SAS)(水中に過剰の硫酸アンモニウムを入れ沸とうさせ、4℃に冷却し、不溶の結晶をろ過し水酸化アンモニウムでpH7.0に調整して得る)を滴下しながら加え沈澱させた。沈澱物と上清液を2時間以上撹拌し、4℃にて遠心分離した。遠心分離は好ましくは、60分間、14,000rpm(30,000×g)で行なう。腹水の上清液はSASでさらに2回沈澱させ、その沈澱物と上清液を第1回目と同様に撹拌し、遠心分離した。3回の沈澱から得られたペレットを希釈した腹水液と等量のPBSで再懸濁した後、PBSに対し充分に透析した。透析袋に凝固物が現われた時、20℃で遠心分離により除いた。透析されたIgGを室温で5%の水酸化アルミニウム水溶液と共に撹拌して吸着させ、吸着後20℃で遠心分離した。吸着処理は第1回目の後少なくとも3回以上、それぞれ2.5%水酸化アルミニウム溶液を用いて繰り返される。吸着されたIgGは4℃にして、上記の如くSASで再沈澱させた。沈澱させたペレットは使用するまで-20℃で貯蔵される。モノクローナルIgG精製の他の方法は、ここで用いた方法と同様にもしくはよりよいものであり、例えば、Bruck,C.,Portetelle,D.,Glimeur,C.,Bollen,A.の記述による「DEAEアフイニテイ-ゲルブル-クロマトグラフイ-による腹水液からのマウスモノクローナル抗体の一段階精製」がJournal Of Immunological Mcthods,53巻、頁313〜319(1982年)に記載されている。
【0020】
B.免疫吸着体の調製
免疫吸着体は、フカップリングのためのモノクローナルIgGを調製し、カップリングのための固体基質を調製し、モノクローナルIgGを固体基質に結合させるため2つの成分を反応させることにより好適に調製される。
【0021】
(i)カップリングのためのIgGの調製
新しく沈澱させたIgGまたは以前に冷凍した沈澱を解凍したものを用いることができる。その物質をPBSに対して透析し、PBS中にある間に、IgGの容量と濃度(A280/1.4=mg/ml IgG)を決定する。次いで、IgG溶液50ml当たり、ジイソプロピルフルオロリン酸の10〜30μl、好ましくは20μlで処理した。得られた溶液を30分間、ドラフト中室温で撹拌し、その処理したIgGを使用直前にカップリング緩衝液に対し一晩透析した。見い出されている最も好適なカップリング用緩衝液は、好ましくは水酸化ナトリウムでpH9に調整された0.25M重炭酸ナトリウム溶液である。
【0022】
(ii)カップリングのための固体基質の調製
モノクローナル抗体はタンパク質、特には第IX因子自体に高い親和性を有するものでなければあらゆる物質に結合されるが、そのような物質として、ガラズビーズ、アガロースおよびそれらの誘導体が好ましい。最も好ましくは、架橋結合されたアガロースで、セフアロース4B(Pharmacia Fine Chemicals,Piscataway,N.J.の登録商標)として知られたゲル市で市販されている。
【0023】
好ましい免疫吸着体樹脂を調製する方法は、一般に文献に記載の方法と同様であり、例えば、J.Porath等による方法、Journal Of Chromatography、86巻、頁53〜56(1973年)がある。見い出された最も好適な方法は、以下の如くである。即ち、容量約2リットルのセフアロース4Bを酸で洗浄した2リットル用の焼結グラスフィルターロートに入れた。樹脂を水洗し、ろ過して水気のある状態にした。水洗した樹脂を回転子を入れた大容量(約4リットル)のガラスビーカーに移した。次いで、5Mの2塩基性リン酸カリウム溶液の1部と5Mの3塩基性リン酸カリウム溶液の2部を混合して調製した750mlの冷リン酸カリウム緩衝溶液を樹脂に加えた。充分に冷却した水を加えて最終容量を3リットルとした。次に、この混合物を4℃に冷却し、マグネチックスターラ上の氷-水浴中で4〜10℃に保持した。ドラフト内で、臭化シアンを回転子を入れた栓付きガラスビンの30mlの水中に加えた。混合物を溶液になるまで迅速に撹拌した。この臭化シアン溶液を先の冷セファロース混合物に2分間以上撹拌しながら加えた。撹拌を続けて8分間行ない、その溶液を4リットルの耐圧ビンに固定した冷2リットル焼結ガラスフィルターロートに移した。次いで、臭化シアン処理した樹脂を約20リットルの冷水で(ろ液のpHが中性になるまで)洗浄した。水洗した樹脂は冷却したカップリング用緩衝液と速やかに平衝状態とし、大きな回転子を入れた4リットルのプラスチックビーカーに移した。
【0024】
(iii)モノクローナル抗体の固体基質へのカップリング
上記の如く調製した固体基質樹脂は、PBSと平衝状態にある時は使用できる状態にあり、それ以後は貯蔵されるべきではない。従って、樹脂混合物は、カップリング反応用緩衝液に対して前もって1晩透析したIgGと結合させた。この結合した樹脂/IgG懸濁混合物を24時間4℃で撹拌した。カップリング時の上清液の無希釈サンプルのA280は、標準試料として牛の血清アルブミン(BSA)を用いてまたは標準試料としてBSAと共にバイオーラド(Bio-Rad)タンパク質分析(ブラッドフオード試薬)により決定される。次に、カップリングしたリガンドのパーセンテージを計算する。上記した手順が行なわれる時、この値は通常約95%である。抗体とカップリングしなかった樹脂上に残っている活性サイトは、0.1Mグリシンを含有する冷カップリング用緩衝液で焼結ガラスフイルターロート上の樹脂を洗浄することによりブロックされる。次いで、この樹脂を樹脂と抗体を結合させた時のそれぞれのカップリング用緩衝液と等容量になるように上記溶液で再懸濁した。懸濁液をゆっくり4℃で1晩撹拌した。次いで、この樹脂をPBSで充分に洗浄した。その組成を以下に示す。カップリングし、ブロックされた上記樹脂は、付加的に0.5Mカルシウムイオン、好ましくは塩化カルシウムを含むPBSで予備溶離される。樹脂を再びPBSのみで洗浄し、4℃で貯蔵するかまたは使用できる用意ができるまで、室温で連続したポンプの働いているカラム内におかれる。セフアロースに対するIgGのカップリング密度は、セフアロース球体1リットル当り2〜5gIgG、好ましくは、3〜4gIgGであろう。
【0025】
C.第IX因子の分離と精製
人や動物の血漿および市販の第IX因子の濃縮物のような第IX因子の試料調製は、本発明の方法を用いることができ、本方法は物質の特定のタイプに限定されない。好適な物質、成功した結果を与えたものとしては、それぞれ目的とするタンパク質を含む人の血漿、血漿分画および濃縮物、市販または一部実験室で精製されたものである。以下の記載では、正常な人の血漿を用いたもので詳細を説明する。新しく採取したものでない血漿は通常の手段でクエン酸塩化され冷凍保存される。使用基準ができた時、35〜40℃、好ましくは37℃の温度で解凍し、カラムに直接入れる。
【0026】
本発明の説明では最初に直接にクロマトグラフ用カラムに免疫吸着体がカップリングされた粒子を入れて使用したが、適当な容器の中へ抗体と結合する樹脂粒子を入れてバツチ法で分離し、その後再構成した濃縮物または血漿を加え、上記で概要を示したように目的とするタンパク質を回収する方法も本発明の範囲にあるものである。以下、さらに詳細に説明する。
【0027】
クロマトグラフ工程を遂行するには、以下の具体例が好ましい。
【0028】
樹脂をカラム、例えばAmicon 86001(Amicon Corp.,Lexigton,Mass.の登録商標)に充填し、ぜん動性ポンプで速やかに流れるようにする。人の血漿を第IX因子源として使用する時、抗体を保持する球体の各容量に対し約3〜7、好ましくは5部の血漿が処理される。血漿はゆっくりとカラムに注がれ、流速は免疫吸着体上に血漿からの第IX因子の望ましい量が吸着される接触時間を与えるものである。より長い接触時間がタンパク質の少なくとも約50%、好ましくは75%、より好ましくは、95%以上を吸着させるのに必要であり、その時間は1〜6時間、好ましくは2〜4時間で一般的に満足される。
【0029】
源物質をカラムに入れた後、50部のトリス-塩化リチウム緩衝液(0.1Mリジン塩基と0.5M塩化リチウム、pH8)で洗浄し、溶離タンパク質を有効に除去する。除去率は好ましくは少なくとも90%、より好ましくは最大の除去である。次いで、第2の洗浄をトリスー塩酸緩衝液(0.05Mトリス-塩酸、pH8)でカラムからリチウムイオンを最大限に除去する条件で行なう。約2〜4時間の接触時間で満足される。
【0030】
精製第IX因子の溶離は、ジエチルアミン、塩化カルシウム、チオシアン酸ナトリウム塩、臭化カリウム、酢酸(好ましくは濃度約0.1〜1.0M)またはpH2〜3、好ましくは約2.2の塩酸一グリシン混合物の如き溶離液を含む緩衝液で行なわれる。他の適当な溶離剤は、当該技術分野の通常の技術で簡単に同定することができる。直線的な濃度勾配の溶離液が良い結果を与えるが、本発明の目的を達成するためには必要はなく、一定のイオン濃度を有する溶液がさらに適当である。流出速度はセフアロースの充填によりカラム内の圧力を上げないでタンパク質の溶離を効果的に行うべきである。このように、第IX因子をチオシアン酸ナトリウムで溶離する時、チオシアン酸ナトリウムの溶離液を2M〜4M、好ましくは3Mを流し、その流速は3リットルカラムにおいて平方インチ当たり9ポンド以上の導入部の圧力を与え、圧力の上昇をしないように行なう。ジエチルアミンの溶離では、0.3〜0.7M、好ましくは0.5Mの濃度で行なわれる。ジエチルアミンを溶離液として用いた場合、分画はジエチルアミンを中和するために1Mグリシン中に集められるべきである。続いて、そのカラムはPBSまたは中性緩衝液で洗浄される。
【0031】
第IX因子活性を含む分画を貯蔵し、その全容量および活性を決定する。溶離された第IX因子を溶液のイオンを除くためにPBSに対して透析し、次いで分析する。溶離された第IX因子は濃度約10〜30ユニット/mlであり、治療または分析に用いることができる。
【0032】
第IX因子を集めた液は限外ろ過のような通常の方法により10〜20mlに濃縮することができる。この目的のためには、窒素圧50psi下でYM-10メンブランとアミコン撹拌セル(Amicon stirred cell)がよいことがわかった。ゆっくりとした撹拌を窒素圧を低下した後30分間続け、濃縮液の容量と活性を決定した。ためた液は温度を4℃に保つならば短期間、例えば1晩貯蔵してもよい。
【0033】
上記した免疫吸着体力ラムはカラムから精製しタンパク質を除く溶離により再生される。カラムはこのように何回でも繰り返し使用できる。
【0034】
分析は通常の部分トロンボプラスチン時間分析(Partial thromboplastin time assay)で行なわれる。
【0035】
すべての緩衝液において、EDTA 4ナトリウム塩の10mMを含んだもの、および/またはすべての処理行程を4℃で行なうことは、第IX因子の活性およびタンパク質分解を最小にする。
【0036】
緩衝液の組成を以下に示す。
【0037】
リン酸緩衝塩溶液
1.6gのリン酸ナトリウム1塩基性1水和物
8.4gのリン酸ナトリウム2塩基性無水物
61.4gの塩化ナトリウム
水を加えて7リットルとする。pHを7.2に調整。
【0038】
上記で説明した手順で7回の実験を行ない、平均回収率52%、その範囲32%〜71%であった。精製度は平均2400倍、比活性は34.8ユニット/mgであった。以下の実施例1で示すデータは、上で述べた本発明で得られたものの代表である。冷凍された正常人の血漿を37℃で解凍し、次いで4℃で処理したものである。
【0039】
実施例1
実験A: 第IX因子活性の1.5ユニット/ml、0.021ユニット/mgを含む人の血漿100mlを免疫吸着体カラムに入れ、最初に血漿を次いで第IX因子を上述した方法に従って溶離した。溶離された第IX因子は31ユニット/mgの比活性を有しており、約1500倍の精製度を示した。第IX因子の回収率63.3%。溶離分画のピークにおいては、第IX因子の濃度の12倍であった。
【0040】
実験B: 第IX因子活性の0.94ユニット/ml、0.013ユニット/mgを含む人の血漿100mlを、すべての緩衝液にEDTA 4ナトリウム塩の10mMを含ませた以外は上記手順と同様にして回収した。溶離した第IX因子は17ユニット/mgの比活性を有し、約1300倍の精製度を示した。回収率は61%、溶離分画のピークにおいては、第IX因子の濃度の8倍であった。
【0041】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、血漿または濃縮物から、平均回収率52%、その範囲32%〜71%、精製度平均2400倍、比活性34.8ユニット/mgの、すなわち、活性で高い純度で精製され濃縮されたかたちの、ビタミンK依存性タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物を得ることができた。
 
訂正の要旨 訂正事項a
特許請求の範囲の請求項1中の「カオトロピック試薬」を特許請求の範囲の減縮を目的として「リチウム塩」と訂正する。
訂正事項b
特許請求の範囲の請求項4を特許請求の範囲の減縮を目的として削除する。この請求項4の削除に伴い、これに続く「請求項5」、「請求項6」をそれぞれ「請求項4」、「請求項5」と訂正する。
訂正事項C
特許請求の範囲の請求項7を特許請求の範囲の減縮を目的として削除する。この請求項7の削除に伴い、これに続く「請求項8」を「請求項6」と訂正する。
異議決定日 1999-08-03 
出願番号 特願平6-19626
審決分類 P 1 651・ 121- YA (A61K)
P 1 651・ 113- YA (A61K)
最終処分 維持  
前審関与審査官 松浦 新司塚中 哲雄  
特許庁審判長 吉村 康男
特許庁審判官 柿崎 良男
小島 隆
登録日 1996-10-24 
登録番号 特許第2573467号(P2573467)
権利者 スクリップス クリニック アンド リサーチ ファウンデーション
発明の名称 第IX因子タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物  
代理人 三好 保男  
代理人 高島 一  
代理人 三好 秀和  
代理人 三好 保男  
代理人 三好 秀和  
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