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| 審決分類 |
審判 査定不服 2項進歩性 特許、登録しない(前置又は当審拒絶理由) C12P |
|---|---|
| 管理番号 | 1253086 |
| 審判番号 | 不服2008-27304 |
| 総通号数 | 148 |
| 発行国 | 日本国特許庁(JP) |
| 公報種別 | 特許審決公報 |
| 発行日 | 2012-04-27 |
| 種別 | 拒絶査定不服の審決 |
| 審判請求日 | 2008-10-27 |
| 確定日 | 2012-03-06 |
| 事件の表示 | 特願2003-580502「ポリペプチド産生を増加させる方法」拒絶査定不服審判事件〔平成15年10月 9日国際公開、WO03/83066、平成17年 7月21日国内公表、特表2005-521401〕について、次のとおり審決する。 |
| 結論 | 本件審判の請求は、成り立たない。 |
| 理由 |
1.手続の経緯・本願発明 本願は,2003年3月27日(パリ条約による優先権主張2002年3月27日,米国)を国際出願日とするものであって,本願発明は,平成20年2月4日付手続補正書により補正された明細書の記載からみて,その特許請求の範囲の請求項1?29に記載された事項により特定されるとおりのものであるところ,そのうちの請求項1に係る発明(以下,「本願発明1」という。)は以下のとおりである。 「【請求項1】 組換えポリペプチドを産生する方法であって 29℃?36℃の温度で哺乳動物細胞株を培養し,そして 培地にハイブリッド極性化合物を添加する ことを含んでなり, 哺乳動物細胞株が,組換えポリペプチドを産生するように遺伝子操作されており,そして ハイブリッド極性化合物を添加すると,該組換えポリペプチドの産生が増加する, 前記方法。」 2.引用例 これに対して,原査定の拒絶の理由に刊行物2として引用された本願優先日前の1999年に頒布された刊行物であるBiotechnol. Bioeng., Vol.63, No.5, p.573-582(以下,「引用例1」という。)は,「CHO細胞の生産性,プロテオーム及び蛋白質りん酸化に及ぼす低温度の影響」と題する論文であり,以下の事項が記載されている。 1-(1)「哺乳動物細胞の増殖は低い培養温度により制御され得る。しかしながら,細胞の種類や発現システムによって,温度シフトが外来タンパク質の産生に与える異なる効果が報告されてきている。ここで,我々は,モデル生産物の分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)を産生するように操作された,チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株XM111-10の増殖の挙動や生産性について解析する。培養温度の37℃から30℃へのシフトは,特異的生産性の最大1.7倍の増加とともに細胞周期の主にG1期での増殖停止を引き起こした。低温培養は,37℃での通常の培養における場合と比較して,全産生量における3.4倍の増加を生み出した。」(第573頁左欄Abｓｔｒacｔ第1?14行) 1-(2)「全生産物を定量化するために,T25フラスコに1×10^(5)細胞ずつ播種し,培養を30℃にシフトする前に,72時間37℃で増殖させた。培地中のSEAPの蓄積を測定し,37℃の標準的な培養で得られた量と比較した(Fig.5)。細胞が37℃で増殖した場合は,最大細胞数に到達したのは120時間後だった。144時間後に細胞が死の段階に入った時には培養を終了した。これに対して,30℃における培養は最終培養期間を最大9日に延長させた。37℃の工程の最大産生量を100%(154mU/mL)とした。低温培養において,SEAPは培養9日後に最大342±4%まで蓄積した(Fig.5)。このように,30℃におけるCHO XM111-10細胞の培養でおよそ3.5倍増の最終産物の力価が得られた。」(第577頁右欄第1?14行) 1-(3)「  図5.温度シフトバッチ培養における細胞の増殖とSEAPの産生 XM111-10細胞を当初細胞密度1×10^(5)細胞ずつT25フラスコに播種し,毎日細胞数を測定した。低温培養は播種から72時間後に37℃から30℃にシフトさせた(×)。標準培養は全期間37℃で培養を行った(□)。同時に低温培養(●)及び37℃培養(▼)におけるSEAP濃度を測定した。37℃培養における最終SEAP収量を100%とした(154mU/mL)。」(第578頁Fig.5) 以上の記載から,引用例1には,分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)を産生するように操作された,CHO細胞株XM111-10を培養してSEAPを産生する方法において,培養温度を37℃から30℃にシフトしたこと,これにより,SEAPの産生が増加したことが記載されているものと認める。 また,同じく,原査定の拒絶の理由に刊行物3として引用された本願優先日前の1994年に頒布された刊行物であるAppl. Microbiol. Biotechnol., Vol.40, No.5, p.691-698(以下,「引用例2」という。)は,「形質転換CHO細胞におけるα1-抗トリプシン発現の最適化へのアプローチ」と題する論文であり,以下の事項が記載されている。 2-(1)「チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞における組換えヒトα1-アンチトリプシン(AAT)の産生を最大にする様々な方法が検討されてきている。高度に活性型で誘導性のヒトサイトメガロウイルスの最初期(IE)プロモーター/エンハンサーが,一時的に形質導入,あるいは,安定に形質転換されたCHO細胞における組換えAAT遺伝子の転写を駆動するために用いられた。・・・血清豊富な培地における細胞の増殖において,これらの修飾により1日あたり最大44μgAAT/ml分泌した。プロピオン酸,酪酸あるいはヘキサメチレンビスアセトアミドによる化学的な発現誘導で,分泌量は100μgAAT/mlまで増加させることが可能であった。」(第691頁左欄Abｓｔｒacｔ第1?19行) 2-(2)「一時的に,あるいは,安定に形質転換された細胞におけるCMVプロモーターからのAAT発現を活性化する,アデノウイルスE1a転写制御因子の能力を検討した。E1aのように,CMVプロモーター/エンハンサーに結合する転写制御因子を介して活性化を仲介すると考えられている化学誘導剤である,フォルスコリン,・・・も検討された。他の化学物質であって,様々な細胞分化剤として機能することが知られている,酪酸,プロピオン酸,ヘキサメチレンビスアセトアミド(HMBA)及びジメチルスルフォキシド(DMSO)についても試験され,AATの収量が顕著に増加することが見出された。」(第692頁左欄第4?17行) 2-(3)「HMBA,DMSO,酪酸,プロピオン酸は全て,いくつかの安定な細胞株におけるAATの発現を誘導した。これら4つ全ての薬剤の効果は類似しており,AATの発現の誘導に加え,培養物の増殖と細胞分裂を停止し,細胞の形態を変化させるものであった(Table6)。HMBA,酪酸,プロピオン酸は,それぞれ,AATの発現レベルを,同じ増殖段階の誘導しない細胞が到達するレベルの3から5倍に誘導することが可能であり,1日あたり最大100μgAAT/ml分泌した。」(第695頁右欄第22?31行) 2-(4)「  表6.10%FCS含有DMEM中の化学誘導物質の作用 細胞は25cm^(2)フラスコにおいて上清中に化学物質を添加することで誘導された。培地は20-30日にわたって3-4日ごとに採取され置換された。採取された培地中に存在するAAT濃度はELISAで測定され,同じ増殖段階の誘導しない細胞の培地における濃度の割合として表された。ここでは対照と比較して最も高い誘導の時点が示されている。AATの最大濃度(1日あたりμg/ml)は角括弧内に示されている。これは実験を通じて記録された一番高いレベルであり,必ずしも最大の誘導割合と同じ時点の試料からではない。・・・」(第696頁Table6) 2-(5)「しかしながら,試験された全ての細胞株は化学物質であるDMSO,HMBA,酪酸及びプロピオン酸による誘導によく反応した。これらの化学物質の作用はよく理解されていない;・・・。その種々の作用はクロマチン構造の修飾やDNAのメチル化によると考えられ,MARｓを介した転写作用を媒介することも報告されてきている(略)。」(第697頁左欄下から第7行?右欄第5行) 以上の記載から,引用例2には,組換えポリペプチドヒトα1-アンチトリプシン(AAT)を産生するように遺伝子操作されたCHO細胞,すなわち,組換えポリペプチドを産生するように遺伝子操作された哺乳動物細胞株を培養して組換えポリペプチドを産生する方法において,培地に,ハイブリッド極性化合物に相当するヘキサメチレン・ビスアセトアミドを添加することにより,組換えポリペプチドの産生が増加したことが記載されているものと認める。 3.対比・判断 (1)対比 本願発明1と引用例1に記載された事項を比較すると,引用例1に記載のSEAP,及び,CHO XM111-10細胞は,それぞれ,本願発明1の組換えポリペプチド,及び,組換えポリペプチドを産生するように遺伝子操作された哺乳動物細胞株に相当する。 また,引用例1には,組換えポリペプチドを産生するにあたり,哺乳動物細胞株を30℃で培養したことが記載されているから,「29℃?36℃の温度で哺乳動物細胞株を培養」することが記載されているものと認める。 そうすると,両者は,組換えポリペプチドを産生する方法であって29℃?36℃の温度で哺乳動物細胞株を培養することを含んでなり,哺乳動物細胞株が,組換えポリペプチドを産生するように遺伝子操作されている点で共通し,以下の点で相違する。 ア.哺乳動物細胞株の培養に際し,本願発明1においては,培地にハイブリッド極性化合物を添加することを含んでなり,それにより該組換えポリペプチドの産生が増加する,のに対し,引用例1においてはそのような記載はない点。 (2)当審の判断 上記相違点について検討する。 ア.相違点アについて 引用例1及び2は,組換えポリペプチドを産生するように遺伝子操作された哺乳動物細胞株における組換えポリペプチドの産生量に与える各種因子の影響を検討している点で共通している(1-(1),2-(1))。 ここで,一般に,細胞を遺伝子操作して組換えポリペプチドを産生するにあたり,その産生量を増加させることは,本願優先日前既に周知の技術的課題であった。そして,産生量を増加させるために,複数の因子を組み合わせて適用することも通常行うことであるから(必要ならば引用例2Table6参照),引用例2において組換えポリペプチドの産生量を増加させることが示された化学誘導剤であるハイブリッド極性化合物を,引用例1に記載された方法においても産生量の増加を期待して添加することは当業者が容易に想到し得たことである。 また,「組換えポリペプチドの産生が増加する」との記載は,ハイブリッド極性化合物を添加したことで奏される結果を記載したに過ぎず,実質的な相違点とはいえない。 あるいは,実質的な相違点であると仮定した場合であっても,引用例1に引用例2を適用することにより予想される結果を単に特定することは,当業者が容易に想到し得ることに過ぎない。 イ.本願発明の効果について 本願明細書の実施例7から9の結果をみると,HMBAを添加しない場合を100%とすると,組換えCHO細胞にHMBA2mMを添加することで,1日あたり10^(6)細胞あたりのタンパク質生産量(μg)は最大160%にまで増加している。一方,引用例2の表6をみると,HMBAを添加しない場合を100とすると,HMBA2.5mM添加により細胞株により差はあるが157から290にまで増加している。これらの結果を比較すると,本願発明1のHMBAを添加することによる生産量の増加の程度は予想できない顕著な効果とはいえない。 また,本願発明1の「ハイブリッド極性化合物」について,本願明細書の段落【0025】には「無極性炭素鎖によって分離される2つの極性基を有する化合物である」と記載されており,段落【0047】から【0054】にはその構造が記載されている。これらの記載にあるように,ハイブリッド極性化合物には,多種の構造を有する化合物が包含される。 ここで,ハイブリッド極性化合物の中で,哺乳動物細胞株の培地に添加した場合に,組換えポリペプチドの産生量を増加させたことが本願発明の詳細な説明において実際に示されたのはHMBAのみであり,HMBAが産生量を増加させる作用機序がハイブリッド極性化合物であることに依っている,つまり,無極性炭素鎖によって分離される2つの極性基を有する構造でありさえすれば,組換えポリペプチド産生増強作用を有することが示されているわけでもないから,ハイブリッド極性化合物でありさえすれば同じ作用を同程度にもつということは示されておらず,ハイブリッド極性化合物であっても同様の作用を有するかどうか,あるいは同様の作用を有している場合であっても,それがどの程度のものであるかは不明であり,細胞に対する作用は構造により異なるものと考えられる。 よって,HMBAのみの結果から,その他の広範な化合物を含むハイブリッド極性化合物全般においてまで同様の効果を奏するということはできない。 さらに,本願明細書の段落【0113】には,哺乳動物細胞株の違いにより培養の最適温度が異なるので,細胞株によっては31℃で培養を行ってもタンパク質の産生量が増加しないこと,組換えポリペプチド産生増強作用を有するカフェインを用いた場合でも,細胞株によっては増強作用がみられないこと,細胞株によりカフェインの最適濃度も異なることが記載されている。これらのことから,細胞株が異なれば,最適な培養温度や誘導因子に対する応答性も異なることが読み取れる。 よって,組換えポリペプチド産生増強作用を有する誘導因子を用いたとしても,哺乳動物細胞株の種類によって,低温で培養を行った場合の反応や誘導因子に対する反応性は異なることが予想されるから,本願実施例7から10において用いたCHO細胞株の結果が哺乳動物細胞株一般における同様の効果を示すものではない。 また,本願発明1において,哺乳動物細胞株を培養する温度は,29℃?36℃の温度であると規定されているが,例えば,本願の図4をみると,上記範囲内の温度であっても,31℃と34℃とでは組換えポリペプチドの産生量が大きく異なることが読み取れるから,29℃?36℃の全ての温度範囲において顕著な産生増強効果を奏する蓋然性は低い。 したがって,本願発明1の構成全体にわたって,当業者が予測できない顕著な効果が奏せられているとはいえない。 エ.小括 したがって,本願発明1は引用例1及び2の記載に基づいて当業者が容易に発明することができたものであり,特許法第29条第2項の規定により特許を受けることができない。 4.審判請求人の主張について 平成20年2月4日付意見書において,請求人は,拒絶理由で引用された引例3(合議体注:引用例2に相当)の表6には,細胞系2.7.19において,PHA(フィトヘマアグルチニン)+PMA(ホルボール-12-ミリステート-13-アセテート)の組み合わせは,これらの誘導因子のうち片方のみを含む培養液よりも,低いタンパク質力価の培養液を産生することが示されていること,さらに,参考文献1(Biotechnol. Bioeng. 72:592-601,2001)には,30℃(本願の低温に相当)での培養,あるいは,ｐ27(サイクリン依存性キナーゼ抑制因子)の過剰発現のいずれもCHO細胞によるタンパク質の産生性を増加させうるが,30℃での培養とｐ27の過剰発現を組み合わせた場合には,生産性が低くなることが記載されていること,これらの本願出願前の学術論文における記載は,誘導因子のある組み合わせは各誘導因子単独よりも有効性が低くなることを示唆し,参考文献1の結果は,特に「化学物質の誘導因子」と「低温」の組み合わせが有利な効果を奏しないであろう,ということを具体的に示唆していることから,低温培養における化学物質の誘導因子の使用が,37℃培養における使用よりも,より高いタンパク質力価をもたらすとは考えられないこと,実施例10及び図4において示された,HMBAによって増強されたタンパク質力価が,低温(図4の31℃又は34℃)での細胞の培養によって,さらに増強されたという効果は予想できない効果であることを主張している。 しかしながら,3.(2)イにおいて述べたように,各種因子に対する反応性は細胞の種類によって異なるものであり,実際に因子を適用してみないとわからないところであって,請求人が指摘している引用例2における特定の細胞に対する特定の誘導因子の組み合わせの結果が,他の細胞においても同様であるとは必ずしも予測できないし,さらに,引用例2の表6には,単独の誘導因子よりも産生量が高くなる組み合わせも記載されていることからも,引用例2の表6の特定の誘導因子の組み合わせの結果が,因子を組み合わせることに対する阻害要因とはいえず,因子を組み合せて使用することに格別な困難性があったものとは認められない。 「化学物質の誘導因子」と「低温」の組み合わせについて,参考文献1に記載されたｐ27過剰発現が「化学物質の誘導因子」といえるかどうか不明である上,ｐ27は,サイクリン依存性キナーゼの抑制因子であり,引用例2に記載されたHMBAは分化誘導因子として知られており,2.2-(5)の記載事項をみても,ｐ27とHMBAはその作用機構が異なるものである。また,本願明細書の段落【0006】及び【0008】に記載されたように,低温処理は細胞を産生相または誘導相にするために行っており,「産生相」について,本願明細書の段落【0030】には,「産生相は,増殖相中よりも細胞分裂が少なく,そしてポリペプチド産生を最大にするよう設計された培地および培養条件を使用することによって特徴付けられる。」と記載されているから,低温にすることで細胞の増殖を抑制しているものと認められる。このことをふまえると,参考文献1においては細胞の増殖を抑制するという同様の作用により生産性を増強する2つの因子を組み合わせたものであり,一方の因子により十分に増殖が抑制されていれば,他方の因子によりそれ以上の増殖抑制効果が必ずしも期待できるものでなく,併用したことによる効果がないのは予想される結果であるに対し,本願発明1の組み合わせは異なる作用の2因子を組み合わせたものであるから,併用したことによる効果を示すことを期待して組み合わせることは当業者が容易に想到できることである。しかも,参考文献1には37℃の場合と比較して30℃の場合で産生量が下がったことが記載されているが,本願発明1には36℃で培養を行う場合も包含されており,37℃から36℃に温度が1℃下がっただけで化学物質の誘導因子であるHMBAの効果がなくなり産生量が低下するとは考えがたい。よって,参考文献1において示された,低温での培養とｐ27の過剰発現とを組み合わせた場合に生産性が下がったという結果が,低温での培養とHMBAとの組み合わせにおいても同様に生産性が下がると予想させるということはできない。 したがって,低温での培養とHMBAの添加を組み合わせることに対する阻害要因が,本願優先日前に存在したものとは認められない。 そして,異なる作用を有する因子を組み合わせた場合に,より産生量が増加するという効果は,当業者が予想できる範囲内の効果であって,請求人が主張する顕著な効果は,3.(2)イに述べたように,本願発明1の全体が奏する効果ではない。 よって,請求人の主張は,採用できない。 5.むすび 以上のとおりであるから,本願請求項1に係る発明は,特許法第29条第2項の規定により,特許を受けることができないものであるから,他の請求項に係る発明について検討するまでもなく,本願は拒絶すべきものである。 よって, 結論のとおり審決する。 |
| 審理終結日 | 2011-09-14 |
| 結審通知日 | 2011-09-15 |
| 審決日 | 2011-09-29 |
| 出願番号 | 特願2003-580502(P2003-580502) |
| 審決分類 |
P
1
8・
121-
WZ
(C12P)
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| 最終処分 | 不成立 |
| 前審関与審査官 | 吉田 知美 |
| 特許庁審判長 |
平田 和男 |
| 特許庁審判官 |
鵜飼 健 六笠 紀子 |
| 発明の名称 | ポリペプチド産生を増加させる方法 |
| 代理人 | 小林 泰 |
| 代理人 | 泉谷 玲子 |
| 代理人 | 増井 忠弐 |
| 代理人 | 富田 博行 |
| 代理人 | 社本 一夫 |
| 代理人 | 千葉 昭男 |