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審決分類 審判 査定不服 2項進歩性 特許、登録しない。 C12N
管理番号 1302261
審判番号 不服2012-3237  
総通号数 188 
発行国 日本国特許庁(JP) 
公報種別 特許審決公報 
発行日 2015-08-28 
種別 拒絶査定不服の審決 
審判請求日 2012-02-20 
確定日 2015-07-06 
事件の表示 特願2007-556120「赤血球の保存のための組成物及び方法」拒絶査定不服審判事件〔平成18年 8月24日国際公開、WO2006/088455、平成20年 8月 7日国内公表、特表2008-529550〕について、次のとおり審決する。 
結論 本件審判の請求は、成り立たない。 
理由 第1 手続の経緯
本願は,2005年2月17日を国際出願日とする出願であって,平成22年11月17日付けの拒絶理由通知に対して,平成23年4月25日に意見書,手続補正書が提出され,同年10月6日付けで拒絶査定がなされ,これに対し,平成24年2月20日に拒絶査定不服審判の請求がなされ,平成25年3月1日付けで上申書が提出され,平成26年1月7日に電話応対により面接希望の意思が継続していないことの確認がなされ,平成26年1月10日付けで上申書が提出されたものである。

第2 本願発明
本願請求項1に係る発明(以下,「本願発明」という。)は,平成23年4月25日付け手続補正により補正された特許請求の範囲の請求項1に記載された事項により特定される,次のとおりのものと認める。

「【請求項1】
赤血球を1?6℃で保存するための水性組成物であって,
前記組成物は,アデニンと,デキストロースと,少なくとも1つの非代謝性の膜保護糖と,pH緩衝系とを含んでおり,
前記pH緩衝系は,重炭酸アニオンを提供する少なくとも1つの物質と,リン酸アニオンを提供する少なくとも1つの物質と,ナトリウムカチオンを提供する少なくとも1つの物質とを含む生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせを有し,
前記pH緩衝系は,1,3-DPGからの2,3-ジホスホグリセレート(DPG)の合成よりも解糖を優先する赤血球内の反応平衡を保存期間中に確立及び維持するのに十分な量の前記組成物が加えられる赤血球(RBC)懸濁液のpHを前記組成物が維持する働きをするのに十分な量で存在し,それによって,保存期間中に前記反応平衡でアデノシン三リン酸(ATP)合成が発生し,
前記組成物は,外部由来の塩化物イオンを含まないことを特徴とする水性組成物。」

第3 引用刊行物記載の事項
原査定の拒絶理由に引用され,本願出願前に頒布された刊行物であるTransfusion (2003), Vol.43, No.7, p.867-872(以下,「刊行物1」という。)には,次の事項が記載されている。
なお,以下の日本語訳は当審によるものであり,下線は当審が付したものである。

(刊1-1)
「BACKGROUND: Better storage can improve RBC availability and safety. Optimizing RBC ATP production and minimizing hemolysis has allowed progressively longer storage.
STUDY DESIGN AND METHODS: In the first study, 24 units of packed CPD RBCs were pooled in groups of four, realiquoted, and added to 300mL of one of four variants of experimental additive solution 76 (EAS-76) containing 45, 40, 35, or 30 mEq per L NaCl. Units were sampled weekly for 12 weeks for morphologic and biochemical measures. In the second study, 10 volunteers donated 2 units of RBCs for a crossover comparison of Tc/Cr 24-hour in vivo recovery of 6-week storage in AS-1 versus 12-week storage in EAS-76 variant 6 (EAS-76v6) having 30 mEq per L NaCl.
RESULTS: RBCs stored in the lower salt variants of EAS-76 had higher concentrations of RBC ATP with less hemolysis and microvesiculation. RBC 2,3 DPG was preserved for two weeks. RBCs stored for 12 weeks in EAS-76v6 exhibited 78 ± 4 percent 24-hour in vivo recovery.
CONCLUSIONS: It is possible to store RBCs for 12 weeks with acceptable recovery and 0.6 percent hemolysis and with normal 2,3 DPG concentrations for 2 weeks.」(867頁左欄)
(当審訳)
「背景:より良い貯蔵が赤血球の有効性と安全性を改善することができる。赤血球のATP生産量を最適化することと,溶血を最小にすることは,革新的により長い貯蔵をもたらした。
設計と方法の研究:第1の研究で,赤血球はCPD液(当審注:血液保存液(CPD(Citrate Phosphate Dextrose)液))にパックされた24のユニットは4つのグループに含まれ,再等分されて,そして45,40,35,あるいは30mEq/lの塩化ナトリウムを含有する実験添加液76(EAS-76)の4つの型の1つの,300mlに加えられた。各ユニットは形態学と生化学的測定のために12週間毎週サンプルを取得された。第2の研究において,10人のボランティアが,AS-1での6週間の保存,対,30mEq/lの塩化ナトリウムを含有するEAS-76のバリアント6(EAS-76v6)での12週間の保存における,テクネチウム/クロム法での24時間後の生体内回収率のクロスオーバー比較のために,2ユニットの赤血球を提供した。
結果:より低い塩の型のEAS-76中に保存された赤血球は,より少ない溶血と微小胞形成で,より高い赤血球ATP濃度を有していた。赤血球2,3-DPGは2週間維持された。12週間EAS-76v6中に保存された赤血球は,78±4%の24時間の生体での回収率を示した。
結論:許容範囲の回収率と0.6%の溶血で12週間,また,正常な2,3-DPG濃度で2週間,赤血球を保存することが可能である。」

(刊1-2)


」(868頁表1)
(当審訳)
「表1.各実験添加液の組成
EAS-76 EAS-76v4 EAS-76v5 EAS-76v6
名称 (mM) (mM) (mM) (mM)
塩化ナトリウム 45.0 40.0 35.0 30.0
重炭酸ナトリウム 30.0 30.0 30.0 30.0
リン酸2ナトリウム 9.0 9.0 9.0 9.0
アデニン 2.0 2.0 2.0 2.0
デキストロース 50.0 50.0 50.0 50.0
マンニトール 30.0 30.0 30.0 30.0
pH 8.4 8.4 8.4 8.4
全ての添加液は赤血球に対して300mlの体積で用いられる。」

(刊1-3)
「RBC unit preparation
Standard units of blood (450 ± 45 mL) were collected in 63 mL of CPD solution in a triple-bag collection system (Code 4R1402, Baxter Healthcare). Units were WBC reduced by filtration (Sepacell RS-2000 filters, Code 4R3303, Baxter Healthcare). RBCs were prepared by centrifugation for 5 minutes followed by removal of all but 65 mL of the plasma, after which 300 mL of the appropriate variant of EAS-76 was added sterilely. Units were stored upright at 1 to 6°C for 12 weeks except for weekly mixing and removal of a 15-mL sample.」(868頁右欄17?27行)
(当審訳)
「赤血球ユニットの準備
血液の標準的なユニット(450±45ml)がトリプルバッグ収集システム(コード 4R1402 ,バクスター・ヘルスケア)中の63mlの CPD液に集められた。ユニットはろ過(Sepacell RS - 2000フィルター,コード 4R3303,バクスター・ヘルスケア)によって白血球を減らされた。赤血球は5分間遠心分離され,引き続いて65mlの血漿以外を除去し,その後,適当なEAS-76の型が無菌状態で加えられた。ユニットは,週に1度の混合と15ミリリットルのサンプルの除去以外,直立状態で1?6℃で12週間保存された。」

(刊1-4)
「RESULTS
Addition of constant volumes of EAS formulated with successively less amounts of NaCl resulted in extracellular suspending media with lower sodium concentrations (Table 3). This, in turn, resulted in successively greater cell swelling measured as the initial MCV.
RBC ATP concentrations decreased during the first week of storage in all groups, increased for the next 2 or 3 weeks, and then declined slowly for the remainder of the storage period (Fig. 1A). The lower salt variants appeared to have a greater initial decrease in ATP concentration (p = 0.058) and a rebound in ATP concentrations that was greater than in the 45 mEq per L version whether measured from 4 weeks on (p =0.04) or from 7 weeks on (p = 0.002).
RBC 2,3 DPG concentrations rose for 1 week to values of about 17μmol per g Hb (1.2 mol/mol Hb) and then declined thereafter (Fig. 1B). Concentrations at 2 weeks averaged 12μmol per g Hb (0.8 mol/mol Hb).
Extracellular pH was equal in all groups and decreased from 7.2 to 6.6 over the course of 12 weeks of storage in all groups (Fig. 1C). During that time, the plasma lactate concentration rose to 32 mM (Fig. 1D), while the bicarbonate concentration decreased from 26 to 8 mEq per L (Fig. 1E). The P_(CO2) reached a maximum value of 135 mmHg at 6 weeks (Fig. 1F).
The morphology of the RBCs was excellent in all of the variants and minimally better for the cells stored in the low-salt variants (Fig. 1G). Hemolysis was within acceptable limits in all variants but was a little lower in the low-salt variants when time-averaged over the last 3 weeks in an analysis of covariance (Fig. 1H). Microvesicle protein measured in the supernatant was lower in the low-salt variants but achieved only borderline significance (p = 0.062, Table 3).
MCV increased with the addition of the more hypotonic EAS-76 variants (Fig. 2A). Despite lower sodium and chloride concentrations, the loss of potassium was the same under all conditions (Fig. 2B-D). Extracellular phosphate concentrations decreased over the first 2 weeks as it moved into RBCs (Fig. 2E). Glucose concentrations decreased as the sugar was metabolized (Fig. 2F). Only the salt content of the AS appeared to affect the MCV.」(869頁右欄19行?870頁48行)
(当審訳)
「結果
連続的により低いナトリウム濃度となるよう設計された一定容量のEASの添加は,より低ナトリウム濃度の細胞外懸濁媒体をもたらした。これは,逆に,初期平均赤血球容積として測定された,連続的により大きくなる細胞膨張をもたらした。
赤血球ATP濃度は全てのグループで保存第1週の間は減少し,続く2,3週で増加し,その後残りの期間はゆっくりと減少した(図1A)。より低い塩分量の型では,ATP濃度のより大きな初期減少(p=0.058)が見られ,4週間での測定か(p=0.04),7週間での測定か(p=0.002)にかかわらず,45mEq/lの型におけるよりも大きなATP濃度の回復がみられた。
赤血球2,3DPG濃度は1週目に約17μモル/gHb(1.2モル/モルHb)まで上昇し,その後減少した(図 1B)。2週目での濃度は,平均して12μモル/gHbとなった。
細胞外pHはすべてのグループで等しく,そしてすべてのグループで12週間の保存の間に7.2から6.6まで減少した(図 1C)。その間に,血漿乳酸濃度が32mMまで上昇し(図 1D),しかし一方,重炭酸塩濃度は26から8mEq/lまで減少した(図 1E)。P_(CO2) は6週目に最大値135mmHgに達した(図 1F)。
赤血球の形態学は全ての型で良好であり,そしてほんのわずかだけ,低塩の型に保存された細胞が,より良かった(図 1G)。溶血は全ての型で許容範囲内にあったが,共分散分析を最後の3週間にわたり時間平均したとき,低塩の型において少しより低いものであった(図 1H)。上澄み液で測定された微小胞タンパク質は低塩の型がより低かったが,ただぎりぎりの有意性(p=0.062,表3)を達成する程度であった。
平均赤血球容積は,より低張のEAS-76の型の添加で増加した(図 2A)。より低いナトリウムとクロライドの濃度にもかかわらず,カリウムの損失はすべての条件下で同じであった(図2B-D)。細胞外リン酸塩濃度は,最初の2週間にわたり,赤血球に移行することにより減少した(図 2E)。 糖分が代謝されたことにより,グルコース濃度は減少した(図 2F)。ただ添加液の塩分量だけが平均赤血球容積に影響を与えるように思われた。」

(刊1-5)
「DISCUSSION
The storage of RBCs requires the continuous provision of metabolic energy. This energy comes mainly from glycolysis.^(14) Its sufficiency can be measured as RBC ATP concentrations. Under the typical conditions of liquid storage in a commercial AS, about 4 mmol of glucose are consumed in 6 weeks. As a result, 8 mmol of lactate and protons are produced, and the pH of the suspending solution decreases from 7.0 to 6.4.^(10) At that final pH, glycolysis is markedly slowed, RBC ATP concentrations decrease to below 2.5μmol per g Hb, and membrane loss increases. Although RBC viability, measured as the 24-hour in vivo recovery, is still 78 to 84 percent at 6 weeks, it falls below 75 percent at 7 weeks in all currently licensed AS storage systems.^(13,15,16)
Longer storage can be achieved by using alkaline AS so that storage starts at a higher pH. Above pH 7.0, more rapid glycolysis leads to ATP production in excess of utilization, and the RBC ATP concentration rises in the first week of storage. Hb is a better buffer above pH 7.0, and the increased acid load is titrated with less decrease in pH.^(17) However, above pH 7.2, glycolysis is diverted to 2,3 DPG production with resulting intracellular inorganic phosphate depletion and inhibition of ATP production.^(18) The range for manipulation of pH is small.
Increased glycolysis can be accommodated by increasing the volume and buffering capacity of the AS. In the present study, the addition of 30mEq per L of sodium bicarbonate led to the buffering of 9 mmol of protons, in addition to the 8 buffered by Hb, allowing the pH to be maintained above 6.6 and the RBC ATP concentration above 3μmol per g Hb for 12 weeks. Doubling the energy available inside the bag appears to double the storage life.
This system worked because the bicarbonate combined with free protons to form carbonic acid which was split by carbonic anhydrase into carbon dioxide and water. As the carbon dioxide diffused out of the plastic bag, the bicarbonate concentration decreased from 26 to 8 mEq per L in the half liter of intra- and extracellular water. The concomitant diffusion of 1 mmol of oxygen into the bag to complete the saturation of the 60 g of Hb caused the release of 0.5 mmol of Bohr protons, a small addition to the already large proton flux. The diversion of 1,3-diphosphoglycerate by pH-activated phosphoglycerol mutase maintained increased concentrations of 2,3 DPG for 2 weeks. The energy cost of the 2,3 DPG synthesis was probably less than 1 mmol of protons judging from the maximum slope of the 2,3 DPG breakdown rate during the third week of storage.
The most important measure of storage-system robustness is normal viability, measured as 24-hour in vivo recovery. The relationship between maintaining RBC ATP concentrations and recovery is increasingly well understood. It has been known for some time that incubating RBCs in rejuvenation solutions to increase ATP increases recovery. In a study by Hogman et al.^(19) incubation for two hours in a warm, neutral solution containing phosphate and adenine increased the recovery fraction from 77 to 89 percent. This means that less than half of the cells removed from the circulation in the first 24 hours were irrevocably damaged. Recently, it has been recognized that the activity of aminophospholipid translocase, which moves phosphotidyl serine from the outer surface of the membrane, is highly sensitive to ATP concentrations and stops working at ATP concentrations typical of the end of RBC storage.^(20) Raising or maintaining RBC ATP prevents this loss. We have shown repeatedly in the development of this series of EAS that membrane loss can also be prevented by maintaining ATP concentrations. Membrane loss reduces RBC deformability, and is correlated with reduced recovery.
We have produced a 12-week RBC storage solution that would meet FDA licensure criteria. It also maintains 2,3 DPG concentrations in the normal range for the first two. Further development of this family of solutions is warranted.」(869頁右欄19行?872頁10行)
(当審訳)
「議論
赤血球の保存は代謝エネルギーの絶え間ない供給を必要とする。このエネルギーは主に解糖から得られる(14)。その充足度は赤血球ATP濃度として測定され得る。流通している添加液中での水溶液保存の典型的な条件下,4mモルのグルコースが6週間で消費される。その結果,8mモルの乳酸塩とプロトンが生産され,そして懸濁液のpHは7.0から6.4まで低下する(10)。最終的なpHにおいて,解糖は著しく遅くなり,赤血球ATP濃度は2.5μモル/gHb以下に減少し,そして膜損傷が増加する。24時間での生体内回収率としての赤血球の生存率は,6週間で依然として78?84%であるが,全ての現在認可されている添加液保存システムの7週間では,75%以下に低下する(13,15,16)。
より長い保存はアルカリ性の添加液を使うことによって達成されることができ,その結果,保存はより高いpHで始まる。pHが7.0を上回ると,いっそう速い解糖が使用量を超過するATP生産量を導き,赤血球ATP濃度は保存の第1週に上昇する。ヘモグロビンは7.0を上回るpHにおいてより良い緩衝剤であり,増加した酸負担量はpHのより少ない減少により滴定される(17)。しかしながらpHが7.2を上回る場合,解糖は,結果として生じる細胞内無機リン酸の枯渇とATP生産の阻害を伴い,2,3DPG生産に転用される(18)。pH操作の範囲は小さい。
増加した解糖が,体積と添加液の緩衝能を増加させることにより,受け入れられ得る。本研究では,30mEq/lの重炭酸ナトリウムの添加が9mmolのプロトンをバッファリングし,ヘモグロビンによりバッファリングされた8に加えて,12週間の間,6.6を上回るpHと,3μモル/gヘモグロビンを上回る赤血球ATP濃度が維持されるようになる。 バッグ中の利用可能なエネルギーを2倍にすることは,保存寿命を2倍にするように思われる。
重炭酸塩が,炭酸脱水酵素によって二酸化炭素と水に分離された炭酸を形成するために遊離のプロトンと結合したことにより,このシステムは働いた。二酸化炭素がビニール袋から放散したので,0.5lの細胞内外の水について,二酸化炭素濃度は26から8mEq/lまで減少した。60gのヘモグロビンの飽和を完了するための,1mモルの酸素のバッグ中への同時の放散は,0.5mモルのボーア・プロトンの放出,つまり,すでに十分大きいプロトンフラックスへの小さい付加を引き起こす。pH活性化されたホスホグリセロールムターゼによる1,3-ジホスホグリセレートの転換が2週間の2,3DPGの濃度の上昇を維持する。2,3DPG合成のエネルギーコストは,保存の第3週の間の2,3DPG分解速度の最大傾斜から判断すると,おそらく,1mモルのプロトンより少ない。
貯蔵システム安定性の最も重要な基準は,24時間の生体回収率として測定される,標準的生存能力である。赤血球ATP濃度の維持と回収率との関係は,ますますよく理解される。それは今までしばらくの間,ATPを増加させるための活性化溶液中での赤血球のインキュベーションが回収率を増加させることが知られていた。Hogmanらの研究(19)では,リン酸塩とアデニンを含む温中性溶液中の2時間のインキュベーションで,77から89%まで回復フラクションが増加した。これは最初の24時間で循環から取り除かれた細胞の半分以下が回復不可能な損傷を受けていたことを意味する。最近,ホスファチジルセリンを膜の外表面から動かすアミノリン脂質転座酵素の活性が,ATP濃度に高感受性であり,典型的な赤血球保存期間の終末期のATP濃度では働くのをやめることが認識されてきた(20)。赤血球ATPの育成または維持が,この損傷を防ぐ。我々は,膜損傷はATP濃度を維持することによっても防ぐことができることを,この系統の実験添加液の発展において繰り返し示してきた。膜損傷が赤血球の変形能を減少させ,そして減少した回収率と相関している。
我々はFDAの免許取得基準を満たすであろう12週間の赤血球保存液を作り出した。それはまた,最初の2週間,2,3DPG濃度を正常な範囲に維持する。この系統の溶液のさらなる発展が必要である。」

(刊1-6)
「18. Hess JR, Hill HR, Oliver CK, et al. Alkaline CPD and the preservation of RBD 2,3-DPG. Transfusion 2002;42:747-52.」(872頁右欄)

第4 刊行物1記載の発明
刊行物1には,摘示(刊1-2)の「Table 1」のとおり,次の発明(以下,「引用発明」という。)が記載されていると認められる。
「以下の組成を有し,赤血球に対して300mlの体積で用いられる組成物EAS-76v6。
塩化ナトリウム 30.0mM
重炭酸ナトリウム 30.0mM
リン酸2ナトリウム 9.0mM
アデニン 2.0mM
デキストロース 50.0mM
マンニトール 30.0mM
pH 8.4 」

第5 対比
本願発明と引用発明を対比する。

1 水性組成物の用途について
刊行物1には,EAS-76が実験添加水溶液であることが記載されている(摘示(刊1-1))から,組成物EAS-76v6が水溶液組成物,すなわち水性組成物であることは明白である。
そして,刊行物1において,塩化ナトリウム濃度の異なる各種実験添加水溶液組成物を用いて赤血球の保存性を検討しているから(摘示(刊1-1)),引用発明の「組成物EAS-76v6」は,本願発明の「水性組成物」と,「赤血球を保存するための水性組成物」である点で一致する。

2 水性組成物の含有成分について
(1)「非代謝性の膜保護糖」について
引用発明のマンニトールは,非代謝性の糖類であり(下記刊行物a乃至c),膜の安定化の目的で赤血球保存液に用いられることも周知であるから(下記刊行物d乃至f),本願発明の「少なくとも1つの非代謝性の膜保護糖」に相当する。

なお,本願明細書の段落【0037】には,「本発明に係る組成物のさらなる実施形態では,少なくとも1つの非代謝性の膜保護糖は,マンニトールである。」と記載されている。

刊行物a:特表2004-503336号公報
(刊a-1)
「【0045】
本発明と一緒に有利に使用することができる鎖錠溶液は、鎖錠溶液の実質的な部分が何日かの間にカテーテルの内腔から拡散又は流出しないような粘度及び密度を有するように作ることができる。本発明において有用な増粘剤としては、公知であるか又は人間を含む動物の処置において一般的に使用される薬学的に容認される物質がある。例としては、限定的ではないが、デキストラン、ポリエチレングリコール、グリセリン、ポリジーン及びソルビトール及びマンニトールのような非代謝性糖類並びにこれらの混合物がある。・・・」

刊行物b:特表2004-523521号公報
(刊b-1)
「【0027】
本発明において、非代謝性糖類及びポリオール類のうちから選ばれる化合物としては、キシロース、アラビノース、ラムノース、フコース、マニトール及びソルビトールからなる群から選ぶことが好ましい。・・・」

刊行物c:特開平2-291221号公報
(刊c-1)
「尚、浸透圧調節剤として、マニトール,ソルビトール等の非代謝性のものを用いる場合には、培地に炭素源を添加する必要があるが、通常この目的に使用されるショ糖,ブドウ糖,果糖等を用いて支障ない。」(2頁右下欄15?20行)

刊行物d:特表平4-504841号公報
(刊d-1)
「マニトールやソルビトールのような膜安定化剤、すなわち「浸透圧調節剤」をこれらの溶液に添加することによっては、これらの溶液中での赤血球細胞の環境的悪影響を完全に補償することはできない。」(4頁左下欄10?14行)

刊行物e:特開平2-187661号公報
(刊e-1)
「さらに赤血球膜安定化剤として,ぶどう糖,ヒドロキシエチルスターチ,D-マンニトール,フェニルメチルスルフォニルフルオライド,ジエチルヘキシルフタレートなどのうちいづれかひとつ,又はそのいづれかを複数組み合わせて用いて赤血球形態の保持効果を増強させた。」(4頁左下欄10?14行)

刊行物f:特開平2-152923号公報
(刊f-1)
「マニトール成分は赤血球の細胞膜強化,及び溶血防止のために,クエン酸及び/クエン酸ナトリウム成分は血液の凝固作用を防止するために添加するもので,添加量としては凝固可能な血液と混和する場合は15mMである。」(2頁右下欄9?13行)

(2)「pH緩衝系」について
引用発明の「重炭酸ナトリウム」について,刊行物1には「30mEq/lの重炭酸ナトリウムの添加が9mmolのプロトンをバッファリングし」と記載されており(摘示(刊1-5)),重炭酸ナトリウムがpH緩衝剤として用いられていることが理解される。また,「リン酸2ナトリウム」は,周知慣用のpH緩衝剤である(下記刊行物g乃至i)。
したがって,引用発明の「重炭酸ナトリウム」と「リン酸2ナトリウム」は,本願発明の「pH緩衝系」に相当する。
そして,「重炭酸ナトリウム」は,本願発明の「重炭酸アニオンを提供する少なくとも1つの物質」であり,「リン酸2ナトリウム」は,本願発明の「リン酸アニオンを提供する少なくとも1つの物質」であることは明白である。かつ,両者ともに「ナトリウムカチオンを提供する少なくとも1つの物質」でもあることも明白である。

なお,本願明細書の段落【0015】には,「本発明のある実施形態は,約1?6℃における赤血球の保存のための組成物を提供する。組成物は,本質的には,アデニンと,デキストロースと,少なくとも1つの非代謝性の膜保護糖と,pH緩衝液系とを含む。pH緩衝液系は,重炭酸ナトリウムとリン酸2ナトリウムとを含み,組成物が約8?9のpHを有するのに十分な量で存在する。」と記載されている。

刊行物g:特開平2-48522号公報
(刊g-1)
「緩衝剤は,塩化ナトリウム,重炭酸ナトリウム,塩化マグネシウム,第一リン酸カリウム,第ニリン酸カリウム,塩化カルシウム,硫酸マグネシウム,第一リン酸ナトリウム,および第ニリン酸ナトリウムのような緩衝剤が選ばれる。
生物学的適合性を考慮し,これらの浸透圧調整剤を組合わせることにより,インビボ及びインビトロでの赤血球破壊を減らしたり,粘性を下げたり,酸化速度を低下させたり,栄養効果を持たせたり,酸性度即ちpHを調整することが可能である。」(9頁右上欄3?14行)

(刊g-2)
「緩衝剤は,pHを予め決められた値に維持させ,かつ浸透圧により浸透圧濃度を維持させることができる。緩衝剤は,非カルシウム沈降性緩衝剤であるイミダゾール,トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン,並びにその他の緩衝剤,例えば重炭酸ナトリウム,第一リン酸カリウム,第ニリン酸カリウム,第一リン酸ナトリウムおよび第ニリン酸ナトリウムを含みうる。」(9頁左下欄1?8行)

刊行物h:特開平6-135851号公報
(刊h-1)
「【0009】また,本発明の組成物は溶液状態で通常pH5?9,好ましくは6?8を示すように調整する。このために該pH領域に維持可能な緩衝剤を通常含有する。緩衝剤としては生理学上許容されるものであればよく,特に限定されないが,塩酸,水酸化ナトリウム,炭酸ナトリウム,炭酸水素ナトリウム,りん酸,りん酸二水素カリウム,りん酸水素二カリウム,りん酸二水素ナトリウム,りん酸水素二ナトリウム,アミノ酢酸,安息香酸ナトリウム,クエン酸,クエン酸ナトリウム,酢酸,酢酸ナトリウム,酒石酸,酒石酸ナトリウム,乳酸,乳酸ナトリウム,エタノ-ルアミン,アルギニンまたはエチレンジアミンの一種以上を含有する緩衝剤が例示される。・・・」

刊行物i:特開平9-20687号公報
(刊i-1)
「【0022】戻し液のpHについては,4から9の間に制御する。好ましくは6.0?8.0の間とする。pH制御の方法としては,通常用いられるリン酸バッファ等を用いることができる。例えば,りん酸水素二ナトリウム(Na_(2)HPO_(4))とりん酸二水素カリウム(KH_(2)PO_(4))からなる緩衝液に生理的電解質物質を加えたりん酸バッファに,前記糖類,バイオポリマー,酸若しくは酸の塩のいずれか1種類以上と細胞賦活剤を添加して,最終的に,そのpHが4から9の間,好ましくは6.0?8.0の間にくるようにすればよい。・・・」

(3)「塩化物イオン」について
本願明細書段落【0024】には「本明細書で使用されている「塩化物」は,アニオン性塩化物を意味する。したがって,「塩化物」という用語は,アニオン性塩化物及びそれらの塩(塩素アニオンと生理学的に許容されるカチオンとから作成される塩など)を含む。「塩化物」という用語は,塩素原子が共有結合している化合物(例えば,炭素原子と塩素とが共有結合した有機分子)を意味するものではない。」と記載され,さらに,段落【0014】には,「従来,塩化ナトリウムは,保存組成物の適切な作用に必要であると考えられた。しかし,本発明者らは,このような組成物から塩化ナトリウムを実質的に除去すると,組成物の性質が向上し,pH緩衝液系の機能が高まることを発見した。」,また,段落【0042】には,「RBC添加液の組成物に食塩水が不要であることと,ATP合成に悪影響を及ぼすことなくデキストロースの濃度を低下させることができることとを発見したことにより,本発明者は,溶液パラメータに生じた「余裕」を利用して,pH緩衝系を増加及び微調整することができた。本明細書に開示されている緩衝液系は,添加液組成物に対して適切な初期pHをもたらすだけでなく,RBCのATP合成を最大限にする細胞内pHを調整するpHをもたらす。緩衝系は,保存期間中にこれらのpH制御を行うことができる。したがって,pH緩衝系の緩衝能力は意図的に調整されている。」と記載されている。
これらの記載から,本願発明の「外部由来の塩化物イオンを含まない」とは,外部由来の塩素アニオンと生理学的に許容されるカチオンとから作成される塩のイオンを含まない,すなわち,外部由来の塩化ナトリウム(食塩)のイオンを含まない,ことを包含している。
これに対し,刊行物1において,塩化ナトリウム濃度は「ナトリウムとクロライドの濃度」として認識されているが(摘示(刊1-4)),引用発明は,30mMの塩化ナトリウムを含むものである。

(4)水性組成物の含有成分についての小括
したがって,引用発明は,本願発明とは,その含有成分として「アデニンと,デキストロースと,少なくとも1つの非代謝性の膜保護糖と,重炭酸アニオンを提供する少なくとも1つの物質と,リン酸アニオンを提供する少なくとも1つの物質と,ナトリウムカチオンを提供する少なくとも1つの物質とを含む生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせを有するpH緩衝系とを含んで」いる点で,共通する。

3 小括
したがって,両発明は,次の(一致点)及び(相違点1)?(相違点2)を有する。

(一致点)
「赤血球を保存するための水性組成物であって,
前記組成物は,アデニンと,デキストロースと,少なくとも1つの非代謝性の膜保護糖と,pH緩衝系とを含んでおり,
前記pH緩衝系は,重炭酸アニオンを提供する少なくとも1つの物質と,リン酸アニオンを提供する少なくとも1つの物質と,ナトリウムカチオンを提供する少なくとも1つの物質とを含む生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせを有する水性組成物。」

(相違点1)
本願発明では,赤血球を保存する温度が「1?6℃」であるのに対し,引用発明では,そのような特定がない点。

(相違点2)
本願発明では,pH緩衝系が「1,3-DPGからの2,3-ジホスホグリセレート(DPG)の合成よりも解糖を優先する赤血球内の反応平衡を保存期間中に確立及び維持するのに十分な量の前記組成物が加えられる赤血球(RBC)懸濁液のpHを前記組成物が維持する働きをするのに十分な量で存在し,それによって,保存期間中に前記反応平衡でアデノシン三リン酸(ATP)合成が発生」するものであるのに対し,引用発明では,そのような特定がない点。

(相違点3)
本願発明では,水性組成物が「外部由来の塩化物イオンを含まない」ものであるのに対し,引用発明では,そのような特定がない点。

第6 判断

1 相違点1について
刊行物1には,赤血球は適当なEAS-76の変型を無菌状態で加えられ,週に1度の混合と15ミリリットルのサンプルの除去以外,直立状態で1?6℃で12週間保存されたことも記載されている(摘示(刊1-3))。
そうしてみると,引用発明の組成物EAS-76v6について,赤血球を保存する温度を「1?6℃」とすることは,当業者が適宜なし得たことである。

2 相違点2について
刊行物1には,「ホスホグリセロールムターゼによる1,3-ジホスホグリセレートの転換」で2,3DPGが合成されること,pHが6.4まで下がると「解糖は著しく遅くなり」,赤血球ATP濃度は減少し,膜損傷が増加すること,pHが7.0を上回ると,「いっそう速い解糖が使用量を超過するATP生産量を導」くが,「pHが7.2を上回る場合,結果として生じる細胞内無機リン酸の枯渇とATP生産の阻害を伴い,解糖は2,3DPG生産に転じる」こと,「pH操作の範囲は小さい」ことが記載されている(摘示(刊1-5))。そして,引用発明の組成物EAS-76v6を用いて赤血球を保存した場合には,塩化ナトリウム濃度がより高い型の組成物を用いた場合に比較して,「より低い塩の型のEAS-76中に保存された赤血球は,より少ない溶血と微小胞形成で,より高い赤血球ATP濃度を有していた。赤血球2,3-DPGは2週間維持された。12週間EAS-76v6中に保存された赤血球は,78±4%の24時間の生体での回収率を示した。」(摘示(刊1-1))と記載されている。
一方,本願発明のpH緩衝系の「前記組成物が加えられる赤血球(RBC)懸濁液のpHを前記組成物が維持する」働きは,pH緩衝系のそもそもの働きであるといえる。
したがって,引用発明のpH緩衝系は,本願発明と同様,「保存期間中に前記反応平衡でアデノシン三リン酸(ATP)合成が発生」する,すなわち,2,3-DPGの合成によってATP合成に必要な無機リン酸が消費されることを防ぎ,ATPを合成する解糖ステップが発生する,ことにより赤血球を良好に保存できる,狭い範囲のpHを維持することを目的とするものであり,引用発明の組成物EAS-76v6は,より高い赤血球ATP濃度を有し,十分な赤血球の回収率を得ている点で,この目的を達成しているといえる。
よって,この点は,公知のpH緩衝系の機能に言及したものに過ぎず,pH緩衝系の特定という観点からみて,実質的な相違点とはいえない。

なお,本願明細書の段落【0032】において,刊行物1の引用文献18(摘示(刊1-5),(刊1-6))が参照され,「pHが7.2のときには,ラパポート・シャント・・・として知られる機構が起きる。この機構では,1,3-DPGから2,3-DPGが合成され,合成に必要なリン酸が消費され,解糖的に2分子のATPを合成する解糖ステップが回避される。系に対するこの機構の正味の影響は,ATPの枯渇である。」と説明されていることからも,引用発明が本願発明と同様のpH範囲を目的としていることが裏付けられる。

3 相違点3について
刊行物1には,45,40,35,30mEq/lの塩化ナトリウムを含有する実験添加液76(EAS-76)の4つの型を比較することで,塩化ナトリウムの量を低減することにより,赤血球の溶血を減少させ,形態変化を抑制できることが記載されている(摘示(刊1-1),(刊1-4))。
そして,下記刊行物AないしCに記載されるとおり,アデニン,デキストロース(当審注:刊行物Bの「ブドウ糖」,刊行物Cの「グルコース」は同義),マンニトール,リン酸のナトリウム塩を含む赤血球長期保存水溶液であって,塩化ナトリウムを含まないものが,本願の優先日前に周知であった(摘示(刊A-1),(刊B-1),(刊B-4),(刊C-2)のARC30,参照)。
したがって,当業者であれば,塩化ナトリウムを必須の成分であると認識していたものとはいえず,引用発明について,刊行物1において低減することが強く動機付けられる塩化ナトリウムの低減をさらにすすめることにより,これを含まない組成とすることが,当業者にとって格別困難であったとはいえない。

刊行物A:特表2000-516963号公報(原査定の引用文献2)
(刊A-1)
「【要約】
酸素除去と添加剤使用による赤血球細胞の長期冷却保存法。赤血球品質を維持し,輸血後の体内生存率を延長するコスト有効性の高い,4℃保存工程を記載する。インビボ生存率の向上,および,アデノシン三燐酸濃度の維持は,4℃で冷蔵した赤血球細胞における溶血および膜小胞生産の低下をも含めて,保存開始時に赤血球中の酸素濃度を減少させることによって,特に,同赤血球細胞を不活性ガスによって噴射し,かつ,それらの細胞をアデニン,デキストロース,マニトール,クエン酸イオン,および,二水素燐酸を含むが,塩化ナトリウムは含まない水溶液において,酸素貧食性物質を含む無酸素環境に置かれる酸素透過性容器中に保存することによって,実現される。」

(刊A-2)
「OFAS1添加液は,FDA承認溶液AS-1(現在の処方では2mMのアデニン,122mMのデキストロース,42mMのマニトール,および,154mMの塩化ナトリウム),および,AS-3(現在の処方では2.2mMのアデニン,61mMのデキストロース,70mMの塩化ナトリウム,20mMのクエン酸ナトリウム,2mMのクエン酸,および,20mMの燐酸水素ナトリウム)に見られる組成を含むが,新規の組成を全く含まない。しかしながら,OFAS1溶液は塩化ナトリウムを含まない。OFAS1液のpHは,水酸化ナトリウムの添加により約7.1に調整される。もちろん,この目的を達するのに他の塩基を使用してもよい。」(12頁11?19行)

刊行物B:特表平5-503304号公報
(刊B-1)
「5.クエン酸ナトリウム,リン酸二水素ナトリウム,リン酸ニナトリウム,アデニン及びマンニトールよりなり300mOsm/l未満の浸透圧を有する,水性の赤血球貯蔵溶液。
6.ブドウ糖を含む,赤血球5(当審注:請求項5の誤記)に記載の水性の赤血球貯蔵溶液。」(1頁請求の範囲)

(刊B-2)
「好ましくは,該溶液は低浸透圧に調整されている。この目的のため,溶液は,好ましくは,塩化ナトリウムを含まない。」(4頁左上欄4?5行)

(刊B-3)
「好ましくは,溶液は塩化ナトリウムを含まない。しかしながら,生理学的浸透圧より僅かに大きい浸透圧を提供するためには,溶液中に最低量の塩化ナトリウムが存在していてよい。」(6頁左上欄9?11行)

(刊B-4)


」(5頁右上欄?左下欄)

刊行物C:特表平5-503075号公報
(刊C-1)
「1.輪注しうる赤血球の貯蔵安定性を延長する方法であって,
(a)該血球の血球内pHを約7.0ないし約8.5の間のレベルに調節すること
(b)該血球を生物学的に適合しうる緩衝溶液中で貯蔵することを含む。
・・・
3.該血球内pHを血球内塩化物濃度を減ずることにより工程(a)において調節する請求項1の方法。
・・・
6.工程(b)における該生物学的に適合しうる貯蔵緩衝液が塩化物イオンを欠いている請求項1の方法。」(1頁請求の範囲)

(刊C-2)



」(8頁右下欄)

4 効果について
本願明細書には,従来,「赤血球保存組成物の適切な作用に必要であると考えられた」塩化ナトリウムを実質的に除去すると,その「余裕」を利用して,緩衝効果を増大させるための緩衝系をさらに追加することができ,pH緩衝液系の機能が高まり(段落【0014】,【0034】,【0042】),RBC保存期間が延長するという利点(1),「本発明の組成物は,従来の量において優れた性能を維持するので,とりわけ大量の輸血を必要とする患者に注入される赤血球の保存に適切である」(段落【0014】)という利点(2)が記載されている。そして,実施例1として,「一般的に本発明に係るEAS-81で保存された細胞は,AS-3で保存された細胞と比較して,エネルギー利用が優れており,それによりATP濃度が高く,溶血の程度が低く,形態が優れており,微小胞が少なく,pHがわずかに高かった。EAS-81よりも古いEAS,特にEAS-76v6は,幾つかの点において,より優れた作用をするが,使用される容量が多いために,保存RBCがさらに希釈され,大量に輸血される患者に対して血液希釈を引き起こしかねない。(段落【0072】)」と記載されている。
ここで,本願発明の実施例1に記載された上記比較例「EAS-76v6」は,引用発明の「EAS-76v6組成物」と組成において一致している。

(1)について
刊行物1には,30mMの重炭酸ナトリウム,9mMのリン酸2ナトリウム,2mMのアデニン,50mMのデキストロース,30mMのマンニトールを含有し,塩化ナトリウム濃度のみが45,40,35,30mMと異なる4つの実験添加液76(それぞれ,EAS-76,EAS-76v4,EAS-76v5,EAS-76v6)を比較することで,塩化ナトリウムの量を低減することにより,赤血球の溶血を減少させ,形態変化を抑制できることが記載されている。また,引用発明のEAS-76v6組成物が,「許容範囲の回収率と0.6%の溶血で12週間」赤血球を保存することが可能であったことも記載されており(摘示(刊1-1),(刊1-4)),保存期間延長の効果は刊行物1において既に達成されている。
そして,塩化ナトリウムが従来,浸透圧の調整にも用いられていること(摘示(刊B-2),(刊B-3)),刊行物1において塩化ナトリウムの量を低減した添加液を「低張」と表現していること(摘示(刊1-4))を考慮すれば,塩化ナトリウムの量を低減した分の別の塩を緩衝系に添加できる,ということも,刊行物1において既に達成されており,これをもって,刊行物1の記載から予測し得ない効果であるとはいえない。

(2)について
本願明細書段落【0072】に記載された,赤血球に対する緩衝系の容積を減らせる効果は,塩化ナトリウムの代わりに重炭酸塩を増加させたEAS-81の固有の効果であって,塩化ナトリウムの代わりに添加する別の塩を特定しておらず,さらにその他の組成についても一切の濃度を特定していない本願発明において,必ず奏される効果であるとはいえない。
なお,このことは,平成26年1月10日付け上申書における審判請求人の以下の主張によっても裏付けられている。
「さらに,血液保存液の組成がわずかでも変わると,赤血球を長期間にわたって保存する能力が劇的に変化しうることは,当業者によく知られたことです。例えば,本願の図2に示すように,本願請求項に係る組成物中の重炭酸塩に変えてクエン酸塩が存在するAS-3では,6週間後の赤血球の回収率が大幅に減少しています。従って,上記文献に記載された血液保存用組成物を組み合わせ,あるいは置き換えることによって,本願請求項に係る発明を予測できたということはできません。」(最終頁下から11?6行)
したがって,使用される容量についての効果は,特定の組成の効果であって,本願発明のすべての水性組成物が,刊行物1記載の事項,及び本願優先日前から周知の技術的事項から予測されるところを超えて優れているともいえない。

5 審判請求人の主張について
なお,審判請求人は,刊行物1に対し,平成24年2月20日付け審判請求書(引用文献1として),及び平成26年1月10日付け上申書(文献3として)において,また,刊行物Aに対し,平成23年4月25日付け意見書,及び平成24年2月20日付け審判請求書(引用文献2として)において,主張を行っているので,念のため以下に検討する。

(1)刊行物1
刊行物1には多くの組成物(EAS-76,EAS-76v4,EAC-76v5及びEAS-76v6)が記載されているが,全て,「外部由来の塩化物イオン」を提供する塩化ナトリウムを必須要素として含むため,これを,塩化物イオンを含まないように構成することは阻害される旨,主張している。
しかしながら,上記「第6 判断 3 相違点3について」で検討したとおり,刊行物1における塩化ナトリウムは必須成分ではなく,刊行物1の記載と周知の技術(刊行物AないしC)に基づいて,塩化ナトリウムをより低減し,これを含まない組成としてみることは,EAS-76,EAS-76v4,EAC-76v5及びEAS-76v6の各組成物により阻害されるものではない。
したがって,上記主張は採用できない。

(2)刊行物A
刊行物Aには,「塩化ナトリウムは含まない赤血球長期保存水溶液」が記載されているが,「塩化ナトリウムがないことによって,どのような効果が生じるか」,「塩化ナトリウム以外から発生する塩化物イオン」について何ら記載されておらず,「塩化物イオンが避けるべき対象であること」は明記されていない旨,主張している。
しかしながら,刊行物Aは,塩化ナトリウムが赤血球長期保存水溶液において必須の成分ではないことを示すものであって,ここにおいて,塩化ナトリウム以外から発生する塩化物イオンが含まれているものでもない。
また,上記「第5 対比 2 水性組成物の含有成分について (3)「塩化物イオン」について」で検討したとおり,本願発明の「塩化物イオン」もまた,「塩化ナトリウム(食塩)のイオン」を包含しているうえ,本願明細書において,「塩化ナトリウム以外から発生する塩化物イオン」について何ら具体的な記載はない(本願明細書段落【0024】,【0042】,実施例)。そして,「塩化ナトリウム以外から発生する塩化物イオン」が,塩化ナトリウムから発生する塩化物イオンとは異なる挙動を示すものともいえない。
したがって,上記主張は失当である。

6 平成26年1月10日付け上申書の補正案について
なお,審判請求人は,平成23年4月25日提出の手続補正書に記載の請求項に係る発明が,新規性または進歩性を有さないと判断されるならば,本願特許請求の範囲を下記補正案のように補正する機会を希望するとしているので,念のため検討する。
その請求項1は,
「赤血球を1?6℃で保存するための水性組成物であって,
前記組成物は,アデニンと,デキストロースと,少なくとも1つの非代謝性の膜保護糖と,pH緩衝系とを含んでおり,
前記pH緩衝系は,重炭酸アニオンを提供する少なくとも1つの物質と,リン酸アニオンを提供する少なくとも1つの物質と,ナトリウムカチオンを提供する少なくとも1つの物質とを含む生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせを有し,前記リン酸アニオンを提供する少なくとも1つの物質は,4?20mMのリン酸2ナトリウムであり,
前記pH緩衝系は,1,3-DPGからの2,3-ジホスホグリセレート(DPG)の合成よりも解糖を優先する赤血球内の反応平衡を保存期間中に確立及び維持するのに十分な量の前記組成物が加えられる赤血球(RBC)懸濁液のpHを前記組成物が維持する働きをするのに十分な量で存在し,それによって,保存期間中に前記反応平衡でアデノシン三リン酸(ATP)合成が発生し,
前記組成物は,外部由来の塩化物イオンを含まないことを特徴とする水性組成物。」(下線は補正箇所を示す。)であり,上記「第2 本願発明」の本願発明に,pH緩衝系の「リン酸アニオンを提供する少なくとも1つの物質」を「4?20mMのリン酸2ナトリウムであり」とする限定を付加するものである。
しかしながら,上記「第3 引用刊行物記載の事項」,「第4 刊行物1記載の発明」に記載したとおり,引用発明は9mMのリン酸2ナトリウムを含有するものであって,上記限定の付加は,「第5 対比」,「第6 判断」を左右しない。

7 小括
そうすると,引用発明において,赤血球を保存する温度を1?6℃とし,公知のpH緩衝系の機能に言及すること,「外部由来の塩化物イオンを含まない」ものとすることは,当業者が容易に想到し得たものといえる。

第7 むすび
以上のとおり,本願発明は,刊行物1に記載された発明,及び周知の技術的事項に基いて,当業者が容易に発明をすることができたものであるから,特許法第29条第2項の規定により特許を受けることができない。
したがって,その他の請求項に係る発明についての判断を示すまでもなく本願は拒絶すべきものである。
よって,結論のとおり審決する。
 
審理終結日 2014-02-06 
結審通知日 2014-02-12 
審決日 2014-02-25 
出願番号 特願2007-556120(P2007-556120)
審決分類 P 1 8・ 121- Z (C12N)
最終処分 不成立  
前審関与審査官 上條 肇  
特許庁審判長 郡山 順
特許庁審判官 小川 慶子
安藤 倫世
発明の名称 赤血球の保存のための組成物及び方法  
復代理人 勝見 陽介  
復代理人 立川 幸男  
代理人 大島 陽一  
復代理人 高尾 智満  
復代理人 木村 政彦  
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