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審決分類 審判 訂正 3項(134条5項)特許請求の範囲の実質的拡張 訂正する A61L
審判 訂正 ただし書き3号明りょうでない記載の釈明 訂正する A61L
審判 訂正 (特120条の4,3項)(平成8年1月1日以降) 訂正する A61L
管理番号 1325154
審判番号 訂正2016-390126  
総通号数 208 
発行国 日本国特許庁(JP) 
公報種別 特許審決公報 
発行日 2017-04-28 
種別 訂正の審決 
審判請求日 2016-10-05 
確定日 2017-01-27 
訂正明細書 有 
事件の表示 特許第5995128号に関する訂正審判事件について、次のとおり審決する。 
結論 特許第5995128号の明細書及び特許請求の範囲を本件審判請求書に添付された訂正明細書及び特許請求の範囲のとおり訂正することを認める。 
理由 第1 手続の経緯
本件特許第5995128号は、平成28年1月20日に出願したものであって、請求項1ないし6に係る発明について同年9月2日に特許権の設定登録がされ、その後、同年10月5日に訂正審判の請求がなされ、同年11月11日付けで訂正拒絶理由通知が通知され、これに対して、同年12月9日に審判請求書に添付された訂正明細書及び審判請求書の請求の理由が補正されるとともに意見書が提出された。

第2 平成28年11月11日付け訂正拒絶理由の概要
訂正事項5及び6は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲または図面に記載した事項の範囲内でするものではない(第126条第5項)、又は、特許請求の範囲の減縮、誤記の訂正、明瞭でない記載の釈明、他の請求項の記載を引用する請求項の記載を当該請求項の記載を引用しないものとすることのいずれを目的とするものにも該当しない(特許法第126条第1項ただし書き)。

第3 平成28年12月9日付け手続補正の適否
1.補正の内容
平成28年12月9日付け手続補正書による手続補正(以下「本件補正」という。)は、審判請求書における「(2)訂正事項」の
「オ.訂正事項5
明細書、段落0025に「リン酸緩衝生理食塩水(PBS)」と記載されているのを、「リン酸緩衝液」に訂正する。
カ.訂正事項6
明細書、段落0033に「PBS」と記載されているのを「リン酸緩衝液」に訂正する。」
を、
「オ.訂正事項5
明細書、段落0025に「緩衝溶液」と記載されているのを、「緩衝液」に訂正する。」に補正するものである。

2.本件補正についての当審の判断
本件補正は、明細書、段落0025に「緩衝溶液」と記載されているのを、「緩衝液」に訂正するという、審判請求時(本件補正前)に申し立てていなかった訂正事項を追加するものであるということができる。すなわち、本件補正は実質的に請求書の請求の趣旨を変更するものであり、審判請求書の要旨を変更するものであるから、特許法第131条の2第1項の規定に違反するものであるといわざるをえない。
しかしながら、当合議体は、事案に鑑み、上述の要旨変更を問わないこととする。

第4 請求の趣旨、訂正の内容
本件訂正審判の趣旨は、補正後の本件訂正審判請求書に添付した訂正明細書及び特許請求の範囲のとおり訂正すること、すなわち下記訂正事項に係る訂正を求めるものである。

1.訂正事項1
特許請求の範囲の請求項1において「?NH-CR^(1)R^(2)」と記載されているのを、「?NH-CHR^(1)R^(2)」に訂正する。
2.訂正事項2
願書に添付した明細書の段落【0012】に「?NH-CR^(1)R^(2)」と記載されているのを、「?NH-CHR^(1)R^(2)」に訂正する。
3.訂正事項3
願書に添付した明細書の段落【0014】に「1?20モル%」と記載されているのを、「1?30モル%」に訂正する。
4.訂正事項4
願書に添付した明細書の段落【0014】に「1/99?20/80」と記載されているのを、「1/99?30/70」に訂正する。
5.訂正事項5
願書に添付した明細書の段落【0025】に「緩衝溶液」と記載されているのを、「緩衝液」に訂正する。

第5 当審の判断
1.訂正の目的について (特許法第126条第1項ただし書)
(1)訂正事項1について
本件訂正前請求項1及び本件訂正前明細書(特許明細書)の請求項1に「R^(1)は疎水性基であり、R^(2)は水素原子または疎水性基である」と記載されていること、及び疎水性基については、本件訂正前明細書の【0013】に「該疎水性基は、炭素数6?18のアルキル基であり、分岐を含んでいてもよい。」と記載されていることからみて、R^(1)及びR^(2)は1価の基であることは明らかである。そして、Nとの結合をあわせてみても、本件訂正前請求項1の「?NH-CR^(1)R^(2)」の式では、炭素原子の結合手が3つしかなく、技術常識に反するものであることから、炭素原子にはさらに1価の基が結合しているはずであるが、その結合しているはずの1価の基の記載が欠落したものと理解できるため、該記載が欠落したままの本件訂正前請求項1の「?NH-CR^(1)R^(2)」は、明りょうでない記載であるといえる。
そして、記載が欠落している1価の基が何であるかについて検討すると、本件訂正前請求項1の「?NH-CR^(1)R^(2)」の式に関連して、本件訂正前明細書には、以下のとおり記載されている。

「【0029】
(2)誘導体化
工程(1)で得られたゼラチン水溶液に、導入する疎水性基を有する誘導体化薬剤を添加し、所定時間撹拌して反応させる。該誘導体化薬剤としては、上記疎水基を有するアルデヒドもしくはケトン、例えばドデカナール、テトラデカナール、デシルエチルケトンが使用される。反応温度は30?80℃、反応時間は0.5?12時間であり、通常、撹拌するだけでゼラチンのアミノ基にシッフ塩基(?N=CR^(1)R^(2))を介してアルキル基が結合されたゼラチンを得ることができる。アルデヒドの使用量は、所望の誘導化率に相当する化学量論量に対して1?4倍とする。より好ましくは、1?2倍とする。
【0030】
次いで、該シッフ塩基を還元して上記式(1)の構造とする。還元剤としてはシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH_(3)CN)、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム(NaBH(OAc)_(3))、2-ピコリンボラン、ピリジンボラン等の、公知の還元剤を使用することができる。これらのうち、2-ピコリンボランが好ましい。ピコリンボランは安定性であり、水性溶媒中でアルデヒドもしくはケトンの還元アミノ化反応を一段(ワンポット)で行うことが可能である。また、80?90%の収率を達成することができ、これはシアノ水素化ホウ素ナトリウムが70?75%であるのに比べて顕著に高い。2-ピコリンボランの使用量は、誘導体化薬剤の当量に対して1?3当量であることが好ましい。」

上記記載によれば、シッフ塩基(?N=CR^(1)R^(2))を還元して、式(1)である本件訂正前請求項1の「?NH-CR^(1)R^(2)」の構造とするものであるから、記載が欠落している、炭素原子に結合した1価の基は水素原子であることは当業者が当然理解するところである。
以上を要すると、炭素原子に結合しているべき1価の基の存在が欠落していて明瞭でない記載である、本件訂正前請求項1の「?NH-CR^(1)R^(2)」を、その欠落している水素原子の存在を明記し、「?NH-CHR^(1)R^(2)」という明瞭な記載としたのであるから、特許法第126条第1項ただし書第3号に規定する明瞭でない記載の釈明を目的とするものである。

(2)訂正事項2について
本件訂正前明細書の段落【0012】に「?NH-CR^(1)R^(2)」と記載されているのを、「?NH-CHR^(1)R^(2)」に訂正することは、上記(1)で検討したとおり、明瞭でない記載の釈明を目的とするものであるといえる。

(3)訂正事項3について
訂正事項3は、本件訂正前明細書の段落【0014】において、疎水性基が結合されたイミノ基の、原料ゼラチン中のアミノ基量に対するモル%の数値範囲の記載について、本件訂正前請求項1の「(c)該ゼラチン誘導体中のイミノ基/アミノ基(モル比)が1/99?30/70である」との記載を言い換えた「ゼラチン中のアミノ基量に対するイミノ基が1?30%」と整合させるため、上限値の20モル%を30モル%に訂正するものであるから、特許法第126条第1項ただし書第3号に規定する明瞭でない記載の釈明を目的とするものである。

(4)訂正事項4について
本件訂正前明細書の段落【0014】に「1/99?20/80」と記載されているのを、「1/99?30/70」に訂正することは、本件訂正前請求項1の「(c)該ゼラチン誘導体中のイミノ基/アミノ基(モル比)が1/99?30/70である」との記載に整合させるため、「20/80」を「30/70」に訂正するものであるから、特許法第126条第1項ただし書第3号に規定する明瞭でない記載の釈明を目的とするものであるといえる。

(5)訂正事項5について
本件訂正前明細書の段落【0025】に「緩衝溶液」と記載されているのを、本件訂正前明細書の【0039】【0040】の「緩衝液」との記載に整合させるため、「緩衝液」に訂正するものであるから、特許法第126条第1項ただし書第3号に規定する明瞭でない記載の釈明を目的とするものである。

2.新規事項追加について(特許法第126条第5項)
(1)訂正事項1について
上記訂正事項1は、願書に最初に添付された明細書の段落【0013】【0029】【0030】の記載に基づき、本件特許明細書に記載した事項の範囲内においてしたものである。そして、訂正後の本件特許明細書の段落【0013】【0029】【0030】も変わらない。
したがって、上記訂正事項1は、願書に最初に添付した明細書、特許請求の範囲に記載した事項の範囲内においてしたものであるから、特許法第126条第5項に規定する要件に適合するものである。

(2)訂正事項2について
上記訂正事項2は、上記2.(1)で検討したとおり、本件特許明細書に記載した事項の範囲内においてしたものである。
したがって、上記訂正事項2は、願書に最初に添付した明細書、特許請求の範囲に記載した事項の範囲内においてしたものであるから、特許法第126条第5項に規定する要件に適合するものである。

(3)訂正事項3について
上記訂正事項3は、願書に最初に添付された明細書の段落【0014】の記載に基づき、本件特許明細書に記載した事項の範囲内においてしたものである。そして、訂正後の本件特許明細書の段落【0014】も変わらない。
したがって、上記訂正事項3は、願書に最初に添付した明細書、特許請求の範囲に記載した事項の範囲内においてしたものであるから、特許法第126条第5項に規定する要件に適合するものである。

(4)訂正事項4について
上記訂正事項4は、上記2.(3)で検討したとおり、本件特許明細書に記載した事項の範囲内においてしたものである。
したがって、上記訂正事項4は、願書に最初に添付した明細書、特許請求の範囲に記載した事項の範囲内においてしたものであるから、特許法第126条第5項に規定する要件に適合するものである。

(5)訂正事項5について
上記訂正事項5は、願書に最初に添付された明細書の段落【0039】【0040】の記載に基づき、本件特許明細書に記載した事項の範囲内においてしたものである。そして、訂正後の本件特許明細書の段落【0039】【0040】も変わらない。
したがって、上記訂正事項5は、願書に最初に添付した明細書、特許請求の範囲に記載した事項の範囲内においてしたものであるから、特許法第126条第5項に規定する要件に適合するものである。

3. 特許請求の範囲の拡張・変更について(特許法第126条第6項)
(1)訂正事項1について
上記訂正事項は、炭素原子に結合しているべき1価の基の存在が欠落していて明瞭でない記載を、その欠落している記載を明記したものであり、特許請求の範囲の記載内容を実質的に変更するものではなく、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。

(2)訂正事項2?5について
上記訂正事項2?5は、上記「1.訂正の目的について (特許法第126条第1項ただし書)」で検討したとおり、本件訂正前明細書の明瞭でない記載を訂正するものであり、本件特許請求の範囲を訂正するものではない。そして、これらの訂正が、本件特許請求の範囲を変化させるものではないことも明らかである。
したがって、上記訂正事項2?5は、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第126条第6項に規定する要件に適合するものである。

第6 むすび
以上のとおりであるから、本件訂正審判の請求に係る訂正は、特許法第126条第1項ただし書第3号に掲げる事項を目的とし、かつ、同条第5項及び第6項の規定に適合する。

よって、結論のとおり審決する。
 
発明の名称 (54)【発明の名称】
外科用シーラント
【技術分野】
【0001】
本発明は、外科用シーラントに関し、詳細には疎水性基を有するゼラチン誘導体を主剤とする外科用シーラントにする。
【背景技術】
【0002】
外科用シーラント又は組織接着剤(以下まとめて「シーラント」という)は、生体組織間の吻合部や損傷部に適用されて膜を形成し、血液の漏出、気体のリーク等を防止する材料であり、呼吸器外科、消化器外科、心臓血管外科、口腔外科等、種々の外科手術において使用されている。現在、最も広く使用されているシーラントは、フィブリンシーラント(商品名ボルヒール:化学及び血清療法研究所製)である。該シーラントは生体親和性に優れるが、組織に対する接着性及び患部のシーリング強度が低いという問題もある。ここで、シーリング強度は膜の耐圧強度もしくは破裂強度で測定され、該強度にはシーラント膜自体の強度と該膜の生体組織への接着強度の双方が要求される。
【0003】
本発明者は、上記問題を解決するシーラントとして、疎水性基を導入したゼラチン誘導体(以下「疎水化ゼラチン」という場合がある)を用いたシーラントの開発を進めてきた(例えば特許文献1、特許文献2)。該シーラントから得られる膜は、組織に対する接着強度及びシーリング強度が高く、体液による膨潤も少ない。
【0004】
しかし、生体材料は上記のような各特性だけでなく、最終製品、即ち最終容器又は包装に収められた形態での耐滅菌性を備えることが重要である。最終滅菌法として日本薬局方には、加熱法、照射法、及びガス法の中から適当な方法を選択すると規定されている(第十四改正日本薬局方、第二部、参考情報、第1235頁)。上記フィブリンシーラントは加熱により最終滅菌されているが、疎水化ゼラチンは加水分解により分子量が低下するため加熱法は適切ではない。また、疎水化ゼラチンは通常、水溶液の形態で供されるのでガス法も適用できない。従って、照射法を用いることになるが、ゼラチンのようなタンパク質を主成分とする材料を変性することなく滅菌するのは大変困難である。
【0005】
例えば、特許文献3はコラーゲンゲルの放射線滅菌に関するものであるが、放射線照射によりコラーゲンゲルの部分的な架橋反応や分解反応を生じさせ、コラーゲンゲルの特性を著しく損なうとし(特許文献3、段落0005)、コラーゲンゲルに熱変性アテロコラーゲン等の放射線保護物質を添加することを提案している。また、ゼラチン等の高分子に多官能トリアジン化合物を配合して、放射線照射する方法が提案されている(特許文献4)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】WO2012/046717号
【特許文献2】WO2014/112208号
【特許文献3】特開平11-137662号公報
【特許文献4】特開2003-695号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかし、変性アテロコラーゲン等の添加は、シーラント膜の特性を低下させる。また、多官能トリアジン化合物は高分子鎖間に分子架橋を形成させて分子架橋を形成することによって劣化を防ぐものであり、シーラントを患部に適用するための流動性を著しく損なう。
【0008】
そこで、本発明は、放射線保護物質等を添加することなく滅菌することができる外科用シーラントを提供することを目的とする。また、本発明は、簡易且つ安全に製造することができる外科用シーラントを提供することをさらなる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
即ち、本発明は、下記のものである:
(1)イミノ基を介して、疎水性基が結合されてなるゼラチン誘導体を含む第1剤であって、該ゼラチン誘導体は
(a)重量平均分子量が10,000?50,000であり、
(b)該疎水性基が炭素数6?18のアルキル基であり、且つ
(c)該ゼラチン誘導体中のイミノ基/アミノ基(モル比)が1/99?30/70である、
第1剤、及び
(2)該ゼラチン誘導体の架橋剤を含む第2剤
からなる外科用シーラント。
【発明の効果】
【0010】
上記シーラントは、その主剤が所定の分子量及び疎水性基を備えることで、耐放射線滅菌性に優れる。該シーラントから得られる膜は、組織に対する接着強度及びシーリング強度が高く、体液による膨潤が少ない。さらに、該シーラントは水性溶媒中で作ることができ、製造環境及び体内において安全であるだけでなく、一段工程で簡易に且つ高い収率で合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】図1は、原料タラ由来ゼラチン、実施例1及び2のゼラチン誘導体のFT-IRスペクトルである。
【図2】重量平均分子量(Mw)13,000?94,000の原料タラ由来ゼラチンを20w/v%で0.1Mホウ酸緩衝液(pH9)に溶解した溶液を、10?40kGyの吸収線量で電子線滅菌した後の写真である。
【図3】原料タラ由来ゼラチン、実施例1及び2のシーラント膜の、37℃の生理食塩水中での膨潤状態を経時的に示す図である。
【図4】原料タラ由来ゼラチン、実施例3?5のシーラント膜の、37℃の生理食塩水中での膨潤状態を経時的に示す図である。
【図5】原料タラ由来ゼラチン、実施例6及び7のシーラント膜の、37℃の生理食塩水中での膨潤状態を経時的に示す図である。
【図6】図3?5に示す膨潤挙動を数値化してプロットしたグラフである。
【図7】実施例4及び6の第1剤の0.1Mホウ酸緩衝液(pH9)溶液(タラ由来ゼラチン誘導体20w/v%)に電子線を照射し、吸収線量を20?60kGyで変化させたときの流動性の変化を示す写真である。
【図8】実施例4及び6の第1剤に電子線を照射した後の粘度変化を示す表である。
【図9】ASTM(F2392-04)に従う外科用シーラントの破裂強度試験の方法の概要を示す図である。
【図10】実施例4及び6のシーラント膜の破裂強度(mmHg)を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
<第1剤>
本発明の外科用シーラントにおいて、第1剤はゼラチン誘導体を含む。該ゼラチン誘導体はイミノ基、即ち、-NH-、を介して結合された疎水性基を有し、下記式(1)で示される構造を有する。
?NH-CHR^(1)R^(2) (1)
上式において、「?」はゼラチン残基であり、R^(1)は疎水性基であり、R^(2)は水素原子又は疎水性基である。Nは、ゼラチン中の主としてリジン(Lys)のε-アミノ基由来である。好ましくは、R^(2)が水素原子である。該式(1)のNH構造は、例えばFT‐IRスペクトルにおいて3300cm^(-1)付近のバンドにより検出することができる。図1は、後述する実施例1及び2のゼラチン誘導体のFT-IRスペクトルを、原料ゼラチンのそれと比較して示すものである。疎水性基の量が増えるにつれ、3300cm^(-1)付近のN-Hの振動及び2900cm^(-1)付近のC-Hの振動が強くなっていることが分かる。
【0013】
R^(2)が疎水性基である場合、R^(1)と同じでも互いに異なっていてもよい。該疎水性基は、炭素数6?18のアルキル基であり、分岐を含んでいてもよい。該アルキル基の例としては、ヘキシル基、オクチル基(又はカプリル基)、ノニル基(又はペラルゴルニル基)、ドデジシル基(又はラウリル基)、テトラデシル基(又はミリスチル基)等が挙げられる。好ましくは、R^(1)が炭素数8?14の直鎖アルキル基であり、R^(2)が水素原子である。
【0014】
該ゼラチン誘導体中の誘導化率は、疎水性基が結合されたイミノ基の、原料ゼラチン中のアミノ基量に対するモル%で、1?30モル%、好ましくは5?10モル%である。言い換えれば、得られたゼラチン誘導体におけるイミノ基/アミノ基(モル比)は、1/99?30/70、より好ましくは5/95?10/90である。該誘導化率は、原料ゼラチン中のアミノ基と、疎水性基を結合した後のアミノ基量を、塩酸等で滴定によって定量することで、或いは、NMR等により疎水性基の同定及び定量を行うことによって求めることができる。
【0015】
該ゼラチン誘導体は、重量平均分子量(Mw)が10,000?50,000、好ましくは10,000?40,000である。前記範囲内において、優れた耐電子線滅菌性を示す。該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)により定法に従い測定することができる。
【0016】
原料ゼラチンは、天然由来、化学合成、発酵法、又は遺伝子組換えにより得られるゼラチンのいずれであってもよい。好ましくは、天然由来、例えばウシ、ブタ、魚由来のゼラチンであり、より好ましくは冷水魚由来、例えばタイ及びタラ、最も好ましくはタラのゼラチンが使用される。冷水魚由来のゼラチンはブタ等のゼラチンに比べて、イミノ酸の含有量が少なく、高濃度でも常温流動性に優れたシーラントを与えることができる。
【0017】
該原料ゼラチンは酸処理ゼラチン、アルカリ処理ゼラチンのいずれであってもよい。好ましくはアルカリ処理ゼラチンである。また、該ゼラチンの分子量の範囲は、ゼラチン誘導体が上述の平均分子量(Mw)の範囲となるような範囲であればよい。
【0018】
第1剤は、上記ゼラチン誘導体に加えて、誘導体化されていないゼラチンを含んでもよい。該ゼラチンとしては、上述の各種ゼラチンを用いることができる。誘導体化されていないゼラチンの量は、ゼラチン誘導体との合計重量の0?99wt%であり、好ましくは、0?50wt%である。
【0019】
第1剤は、水性溶媒をさらに含み、該ゼラチン誘導体を該水性溶媒に溶解又は分散して水性溶液(以下、単に「水溶液」という場合がある)として供されることが利便性の点で好ましい。該水性溶媒としては、超純水、生理食塩水、ホウ酸、リン酸、炭酸等各種無機塩緩衝液又はこれらの混合物を用いることができる。好ましくはpH8?11、より好ましくはpH9?10のホウ酸緩衝液が使用される。該水性溶媒は、ゼラチン誘導体が10?80wt/v%、好ましくは15?30wt/v%となるような量で使用される。誘導体化されていないゼラチンを含む場合には、ゼラチン誘導体との合計重量が上記濃度となる量である。
【0020】
<第2剤>
本発明において、第2剤はゼラチン誘導体の架橋剤であり、水、血液等の体液に不溶性の構造体を形成する。該架橋剤としては、ゼラチン中のアミノ基、主として側鎖の第一級アミノ基、と反応性の官能基を分子中に少なくとも2つ以上有するものの少なくとも一種が使用される。架橋剤の例としては、ゲニピン、N-ヒドロキシスクシンイミドもしくはN-ヒドロキシスルホスクシンイミドで活性化された多塩基酸、アルデヒド化合物、酸無水物、及びジイソチオシアンネートが挙げられる。
【0021】
多塩基酸としては、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、グルタル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、オキサロ酢酸、cis-アコニット酸、2-ケトグルタル酸、ポリ酒石酸、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等が例示され、これらのカルボキシル基が活性エステル化されたもの、例えばジスクシンイミジルグルタレート(DSG)、ジスクシンイミジルスベレート(DSS)、ジスクシンイミジルタートレート(DST)等を使用することができる。
【0022】
また、ポリエチレングリコールもしくはポリエチレングリコールエーテルの、多塩基酸エステルで、該多塩基酸の、ポリエチレングリコールと反応していないカルボキシル基の少なくとも1つが活性エステル化されたもの、例えば4,7,10,13,16-ペンタオキサノナデカン二酸ジ(N-スクシンイミジル)、及び下記式で表されるポリエチレングリコール ジ(スクシンイミジル スクシネート)(SS-PEG-SS):
【化1】

(nはMnが約20,000となる数);
さらに、下記式で表されるペンタエリスリトール‐ポリエチレングリコールエーテル テトラスクシンイミジル グルタレート(4S-PEG):
【化2】

(nはMnが約10,000となる数);
が挙げられる。
【0023】
アルデヒド化合物としては、1分子中に2つ以上のアルデヒド基が導入された、アルデヒド基導入多糖類、例えばアルデヒド基導入デンプン、アルデヒド基導入デキストラン、及びアルデヒド基導入ヒアルロン酸が、酸無水物としては、無水グルタル酸、無水マレイン酸、及び無水コハク酸が、ジイソチオシアンネートとしてはヘキサメチレンジイソチオシアネート等が例示される。これらのうち、上記活性化ポリエチレングリコール多塩基酸エステル、及びアルデヒド基導入多糖類が好ましく使用される。
【0024】
これらの架橋剤は、ゼラチン誘導体のアミノ基1当量に対して、該架橋剤中の官能基、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたエステル基、が0.2?3当量、好ましくは0.3?2当量、より好ましくは0.4?1.2当量となる量で使用される。2種以上の架橋剤の混合物を用いてもよく、その場合はそれらの合計当量が上記範囲となる量とする。
【0025】
第2剤も、該架橋剤を溶解するための水性溶媒をさらに含むことが好ましい。但し、該架橋剤と該水性溶媒とを別々の容器で供し、使用に際して、使用の約2時間前以後に、両者を適量混合して水性溶液(以下、単に「水溶液」という場合がある)として使用することが好ましい。該水性溶媒については、第1剤について上記したものを使用することができる。好ましくは、pH3?8、より好ましくはpH4?6のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)が使用される。最も好ましくは、第1剤の水溶液と第2剤の水溶液を同体積で混合した際に、pHが8?9となるように双方の水性溶媒のイオン強度が調整される。例えば、第1剤水溶液をpH9、イオン強度0.05?0.1のホウ酸緩衝液とし、第2剤水溶液をpH4、イオン強度0.01?0.03のリン酸緩衝液とすることで、同体積で混合した際に8?9のpHとすることができる。又は、第1剤水溶液をpH10、イオン強度0.05?0.1のホウ酸緩衝液として、第2剤水溶液をpH4、イオン強度0.01?0.07のリン酸緩衝液としてもよい。
【0026】
第2剤は、第1剤中のアミノ基の当量に対する第2剤中の官能基の当量、即ち(第2剤中の官能基当量/第1剤中のアミノ基当量)が、上記範囲になるように調整される。2種以上の架橋剤の混合物を用いてもよく、その場合はそれらの合計が上記範囲となる量とする。
【0027】
<添加剤>
上記第1剤及び/又は第2剤は、各種添加剤を本発明の目的を阻害しない量でさらに含んでよい。該添加剤としては、着色料、pH調整剤、粘度調整剤、保存剤等が挙げられる。好ましくは、シーラントの適用箇所が分かり易いように、第1剤あるいは2剤水溶液中に着色料、例えばブリリアントブルーを添加する。添加量は、例えば10?100μg/mLであってよい。
【0028】
<製造方法>
本発明のシーラントは、第1剤と第2剤を個別に調製することによって得ることができる。
[第1剤の調製法]
(1)原料ゼラチン水性溶液の調製
出発材料のゼラチンを5?50wt/v%となる量で、40?90℃で加熱して水性溶媒に溶解する。該水性溶媒としては、水と水溶性有機溶媒との混合物を用いる。該水溶性有機溶媒としては、炭素数1?3のアルコール、エステル等を用いることができ、好ましくはエタノールが使用される。
【0029】
(2)誘導体化
工程(1)で得られたゼラチン水溶液に、導入する疎水性基を有する誘導体化薬剤を添加し、所定時間撹拌して反応させる。該誘導体化薬剤としては、上記疎水基を有するアルデヒドもしくはケトン、例えばドデカナール、テトラデカナール、デシルエチルケトンが使用される。反応温度は30?80℃、反応時間は0.5?12時間であり、通常、撹拌するだけでゼラチンのアミノ基にシッフ塩基(?N=CR^(1)R^(2))を介してアルキル基が結合されたゼラチンを得ることができる。アルデヒドの使用量は、所望の誘導化率に相当する化学量論量に対して1?4倍とする。より好ましくは、1?2倍とする。
【0030】
次いで、該シッフ塩基を還元して上記式(1)の構造とする。還元剤としてはシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH_(3)CN)、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム(NaBH(OAc)_(3))、2-ピコリンボラン,ピリジンボラン等の、公知の還元剤を使用することができる。これらのうち、2-ピコリンボランが好ましい。ピコリンボランは安定性であり、水性溶媒中でアルデヒドもしくはケトンの還元アミノ化反応を一段(ワンポット)で行うことが可能である。また、80?90%の収率を達成することができ、これはシアノ水素化ホウ素ナトリウムが70?75%であるのに比べて顕著に高い。2-ピコリンボランの使用量は、誘導体化薬剤の当量に対して1?3当量であることが好ましい。
【0031】
(3)精製
工程(2)で得られた反応溶液に、大過剰の貧溶媒、例えば冷エタノールを加えて、ゼラチン誘導体を沈殿させる。該沈殿を濾別した後、エタノール等で洗浄して、最終生成物を得る。
【0032】
(4)第1剤の調製
工程(3)で得られたゼラチン誘導体を、ホウ酸緩衝液等の水性溶媒に上述の範囲となる量で溶解することが好ましい。所望により、誘導体化されていないゼラチン、その他添加剤を添加してよい。得られた第1剤を、例えばポリプロピレン等のプラスチック製ディスペンサ等の所定の容器に充填する。好ましくは、外科用シーラントを患部に適用する際に使用する、先端部で両剤を混合することができるダブルシリンジ型ディスペンサ等の一方に第1剤の水溶液を充填する。
【0033】
[第2剤の調製法]
第2剤として例示した上記各架橋剤は、公知の方法で合成してもよいし、市販されているものを使用してもよい。該架橋剤と、それを溶解するための、例えばPBS等の水性溶媒を別々の容器、例えば架橋剤をガラス製のバイアルに、水性溶媒をプラスチックボトルに入れて供する。
【0034】
<放射線滅菌>
次いで、ディスペンサに充填された水溶液の形態の第1剤、バイアルに充填された粉末形態の架橋剤、及びボトルに充填された該架橋剤を溶解するための水性溶媒を夫々放射線滅菌する。該放射線としては、電子線、ガンマ線、制動放射線が挙げられ、電子線滅菌が好ましい。吸収線量としては、従来広く用いられている(第十四改正日本薬局方、第二部、参考情報、第1235頁、右欄、2.2放射線法)25kGyか、それ以上であればよく、好ましくは25kGy?45kGyである。
【0035】
<組織への適用方法>
本発明の外科用シーラントは、皮膚、血管、腱、神経、腸、及びリンパ管等の管状組織、肝臓、膵臓、及び心臓などの臓器の断裂部分に適用することができる。なかでも、湿潤組織、例えば、血管、肺等に好適に適用される。外科用シーラントの適用方法としては、上述のとおり第2剤を、好ましくは使用直前に水溶液とする。その際の架橋剤の濃度は、既に述べたとおりである。得られた第2剤水溶液を、既に第1剤水溶液が充填されているダブルシリンジ型ディスペンサの空いている方のシリンジに充填して適用し、又は、ダブルシリンジを備えるエアアシストスプレーで噴霧して患部に施与する。
【0036】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[基礎実験1:ゼラチン分子量の耐電子線滅菌性への影響]
原料ゼラチンの分子量の違いによる耐電子線滅菌性の違いを、種々の重量平均分子量(Mw)のタラ由来のゼラチン(新田ゼラチン(株)製)を用いて調べた。タラ由来のゼラチンを20w/v%となる量で0.1Mホウ酸緩衝液(pH9)に、80℃で20分間加熱して溶解した。得られた溶液を、10?40kGyの吸収線量で電子線滅菌した。結果を図2に示す。同図から、Mw60,000未満であれば電子線による変性がなく、Mw38,000以下であれば十分な耐電子線滅菌性があることが分かった。
【0037】
[実施例1?7]
<第1剤の調製>
タラ由来のゼラチン(Mw13,000、新田ゼラチン(株)製)を水350mLに溶解し、得られた水溶液にエタノール140mLを加えて50℃にて撹拌した。ゼラチンのアミノ基に対して、表1に記載の誘導化率に相当する化学量論量の1.5当量のドデカナールを5mLエタノールに溶解して、ゼラチン溶液に混合し、次いでドデカナールの約1.5当量の2-ピコリンボランを加えて、18時間撹拌した。反応溶液の10倍体積量の冷エタノール中に該反応溶液を滴下して、生成されたゼラチン誘導体を再沈殿させ、吸引ろ過を行った。得られた沈殿物の約5倍体積量の冷エタノール中に該沈殿物を入れ、1時間撹拌しながら洗浄後吸引ろ過を行った。この洗浄を3回行った後、2日間真空乾燥して、ドデシル基が導入された白色のゼラチン誘導体1を、収率は約82%で得た。誘導化率は、塩酸による滴定法により確認した。
【0038】
タラ由来のゼラチンの分子量(Mw)を24,000又は38,000に変え、又はドデカナールをテトラデカナールに変えたことを除き上記ゼラチン誘導体の調製方法と同様の方法で、表1に示すゼラチン誘導体を調製した。
【表1】

【0039】
上記各ゼラチン誘導体を、pH9の0.1Mホウ酸緩衝液に、実施例1及び2は20w/v%で、実施例3?7は15w/v%で溶解し、得られた溶液を、2.5mLのポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、各第1剤とした。
【0040】
<第2剤の調製>
第2剤として、ペンタエリスリトール‐ポリエチレングリコールエーテル テトラスクシンイミジル グルタレート(4S-PEG、Sigma-Aldrich社製)を用いた。下記各評価の直前に、ブリリアントブルーを100μg/mL含むpH4のリン酸緩衝液に、実施例1及び2では第1剤の残存アミノ基に対して4S-PEGのスクシンイミドエステル基の当量比(モル比)が0.75となるように、他の実施例では0.5となるように調製した量を溶解し、得られた水溶液を第1剤と同様のシリンジに収納して第2剤とした。
【0041】
[評価]
<膨潤性>
第1剤と第2剤を夫々200μlずつ、厚さ1mmのシリコーンゴムをスペーサーとする2枚のガラス板間に流し込み、板状のシーラント硬化物を作成した。得られたシーラント硬化物を直径15mmのポンチでくりぬくことにより、厚さ1.0mm、直径15mmの円形シーラント膜を調製した。シーラント膜を37℃の生理食塩水中に浸漬し、経過時間によるシーラント膜の重量の変化から膨潤性を調べた。なお、本評価においては上記試験片を作成するために第1剤はpH8の0.1MPBS溶液とし、及び(架橋剤中のスクシンイミドエステル基の当量/ゼラチン誘導体中のアミノ基の当量)比は、実施例1,2において0.75、実施例3?5において0.5及び実施例6、7において0.5とした。また、比較例として、誘導体化していないゼラチンを用いた。
【0042】
図3?5に時系列のシーラント膜の写真を、及び図6に数値化した膨潤度((含水重量-乾燥重量)/乾燥重量)をプロットしたものを示す。なお、これらの図において、例えば「4.2C12」は誘導化率4.2モル%で、ドデシル基で誘導化されていることを示す。これらの結果から、アルキル基による誘導化により、シーラント膜の膨潤性が改良され、特に原料ゼラチンのMwが13,000、24,000では、改良の程度が顕著であることが分かる。
【0043】
<第1剤の電子線滅菌>
実施例4及び実施例6で調製したゼラチン誘導体を夫々15wt/v(%)でpH9の0.1Mホウ酸緩衝液に溶解して、2.5mLのポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填した。これらに電子線を照射し、吸収線量を20?60kGyで変化させたときのゲル化による流動性の変化によって劣化の程度を調べた。図7に電子線照射後の試料の写真を、図8に各吸収線量での照射後の試料の粘度を示す。図8において、「EB-」は電子線照射前を、「EB+」は電子線照射後を示す。
【0044】
図7に示すように、いずれの実施例も60kGyまで流動性を維持した。また、粘度も最高値で80mPa・S以下であり、いずれも問題なく患部に適用できることが確認された。原料ゼラチンでは、低分子量の方が電子線照射による劣化が少なかったが(図2)、ゼラチン誘導体ではゼラチンの38,000のものがより優れた耐滅菌性を示した(図8)。
【0045】
<シーリング強度測定>
実施例4及び6の、初期及び吸収線量40kGyでの電子線滅菌後の双方について、ASTM(F2392-04)に従い、図9に示す装置を用いて、ブタ大動脈(φ30mm)を基材として用いた破裂強度測定を行うことによって、シーリング強度(耐圧強度)を測定した。第1剤と第2剤をそれぞれ200μlずつ混合し(架橋剤中のスクシンイミドエステル基の当量/ゼラチン誘導体中のアミノ基の当量=0.5)、前記ブタ大動脈に塗布することで、厚さ1.0mm、直径15mmのシーラントを調製した。塗布後、5.0g/mm^(2)の荷重により10分間の圧着を行った後、37℃の生理食塩水を2ml/分で流し、破裂したときの圧力の測定を行った。
比較例として、市販のフィブリンシーラント(ボルヒール:化学及び血清療法研究所製)を用いた。結果を図10に示す。
【0046】
図10に示すとおり、本発明のシーラントは、電子線滅菌後であってもフィブリンシーラント(約20mmHg)に比べて顕著に高いシーリング強度を示した。該フィブリンシーラントは、該シーラントとブタ大動脈基材との界面で剥離したが、本発明のシーラントは、シーラント膜自体が破壊された。ここから、本発明のシーラントは接着強度にも優れることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【0047】
本発明の外科用シーラントは水性溶媒中、一段工程で高い収率で合成することができ、耐電子線滅菌性に優れる。該シーラントから得られる膜は、組織に対する接着強度及びシーリング強度が高い上に体液による膨潤が少なく、臨床での使用に大変適する。
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
(1)疎水性基が結合されてなるゼラチン誘導体を含む第1剤であって、該ゼラチン誘導体は
(a)重量平均分子量が10,000?50,000であり、
(b)該疎水性基が炭素数6?18のアルキル基であり、
(c)該ゼラチン誘導体中のイミノ基/アミノ基(モル比)が1/99?30/70であり、且つ
(d)該ゼラチン誘導体は下式の構造によって該疎水性基と結合され、
?NH-CHR^(1)R^(2)
上式において?はゼラチン残基であり、R^(1)は疎水性基であり、R^(2)は水素原子または疎水性基である
第1剤、及び
(2)該ゼラチン誘導体の架橋剤を含む第2剤
からなる、放射法による滅菌への耐性を有する外科用シーラント。
【請求項2】
該ゼラチンが、冷水魚由来のゼラチンである、請求項1記載の外科用シーラント。
【請求項3】
該冷水魚がタラである、請求項2記載の外科用シーラント。
【請求項4】
該架橋剤が、少なくとも2つの活性化されたエステル基を有する、ポリエチレングリコールエーテル多塩基酸エステルである、請求項1?3のいずれか1項記載の外科用シーラント。
【請求項5】
(該架橋剤の官能基の当量/該ゼラチン誘導体のアミノ基の当量)が0.2?2となる量で使用される、請求項1?4のいずれか1項記載の外科用シーラント。
【請求項6】
前記第1剤が吸収線量60kGy以下の放射法の滅菌に対して耐滅菌性を有する、請求項1?5の何れかに記載の外科用シーラント。
 
訂正の要旨 審決(決定)の【理由】欄参照。
審理終結日 2016-12-27 
結審通知日 2017-01-04 
審決日 2017-01-19 
出願番号 特願2016-9257(P2016-9257)
審決分類 P 1 41・ 853- Y (A61L)
P 1 41・ 841- Y (A61L)
P 1 41・ 854- Y (A61L)
最終処分 成立  
前審関与審査官 金田 康平  
特許庁審判長 須藤 康洋
特許庁審判官 齊藤 光子
関 美祝
登録日 2016-09-02 
登録番号 特許第5995128号(P5995128)
発明の名称 外科用シーラント  

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