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審決分類 審判 全部無効 特36条4項詳細な説明の記載不備  C12N
審判 全部無効 2項進歩性  C12N
審判 全部無効 特36条6項1、2号及び3号 請求の範囲の記載不備  C12N
管理番号 1375241
審判番号 無効2017-800022  
総通号数 260 
発行国 日本国特許庁(JP) 
公報種別 特許審決公報 
発行日 2021-08-27 
種別 無効の審決 
審判請求日 2017-02-24 
確定日 2021-04-20 
訂正明細書 有 
事件の表示 上記当事者間の特許第5343303号発明「L-グルタミン酸生産菌及びL-グルタミン酸の製造方法」の特許無効審判事件について、次のとおり審決する。 
結論 特許第5343303号の明細書、特許請求の範囲を、訂正請求書に添付された訂正明細書、特許請求の範囲のとおり、訂正後の請求項[1?11]、12について訂正することを認める。 特許第5343303号の請求項1?2及び4?12に係る発明についての審判請求は成り立たない。 特許第5343303号の請求項3に係る発明についての審判請求を却下する。 審判費用は参加によって生じた費用を含めて、請求人及びその参加人の負担とする。 
理由 第1 手続の経緯
本件特許第5343303号に係る出願は、平成17年12月28日(優先権主張 平成16年12月28日、平成17年9月9日)の出願であって、平成25年8月23日に特許権の設定登録がなされたものである。
本件特許についての無効審判の手続の経緯の概要は以下のとおりである。
平成29年2月24日 審判請求書
平成29年4月20日 手続補正書及び上申書
平成29年7月7日 答弁書及び訂正請求書
平成29年10月2日 弁駁書
平成29年11月2日 参加申請書
平成29年12月25日 参加許否の決定
平成30年4月12日 審理事項通知書
平成30年5月22日 口頭審理陳述要領書(請求人及び被請求人)
平成30年6月5日 口頭審理
平成30年6月26日 上申書(被請求人)
平成30年9月27日 補正許否の決定

第2 訂正請求について
1.平成29年7月7日付け訂正請求(以下、「本件訂正」という。)の内容
本件訂正における訂正事項は、以下のとおりである。

(1)訂正事項1
特許請求の範囲の請求項1の(ii)に「1若しくは数個」とあるのを、「1?5個」に訂正する。

(2)訂正事項2
特許請求の範囲の請求項2に「424位及び/または437位のプロリンを他のアミノ酸に置換する変異である」とあるのを、「424位のプロリンをアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなる群から選ばれる1個のアミノ酸に置換し、及び/または437位のプロリンをスレオニン、セリン及びチロシンからなる群から選ばれる1個のアミノ酸に置換する変異である」に訂正する。

(3)訂正事項3
特許請求の範囲の請求項3を削除する。

(4)訂正事項4
特許請求の範囲の請求項4に「前記(ii)の変異は、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、100位のアラニン及び/または111位のアラニンを他のアミノ酸に置換する変異である、請求項1に記載のコリネ型細菌」とあるのを、「L-グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、変異型yggB遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してL-グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって、前記変異型yggB遺伝子の変異は、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、100位のアラニンをスレオニンに、及び/または111位のアラニンをスレオニンもしくはバリンに置換する変異である、コリネ型細菌」に訂正する。

(5)訂正事項5
特許請求の範囲の請求項5に「前記(ii)の変異は、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、14位のロイシンと15位のトリプトファンの間に1又は数アミノ酸を挿入する変異である、請求項1に記載のコリネ型細菌」とあるのを、「L-グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、変異型yggB遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してL-グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって、前記変異型yggB遺伝子の変異は、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、14位のロイシンと15位のトリプトファンの間に1?5アミノ酸を挿入する変異である、コリネ型細菌」に訂正する。

(6)訂正事項6
特許請求の範囲の請求項6に「請求項1?5」とあるのを、「請求項1、2、4及び5」に訂正する。

(7)訂正事項7
特許請求の範囲の請求項7に「請求項1?6」とあるのを、「請求項1、2及び4?6」に訂正する。

(8)訂正事項8
特許請求の範囲の請求項8に「請求項1?7」とあるのを、「請求項1、2及び4?7」に訂正する。

(9)訂正事項9
特許請求の範囲の請求項9に「請求項1?8」とあるのを、「請求項1、2及び4?8」に訂正する。

(10)訂正事項10
特許請求の範囲の請求項10に「請求項1?9」とあるのを、「請求項1、2及び4?9」に訂正する。

(11)訂正事項11
特許請求の範囲の請求項11に「請求項1?10」とあるのを、「請求項1、2及び4?10」に訂正し、「該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体からL-グルタミン酸を回収する」とあるのを、「該培地中に生成蓄積させ、該培地からL-グルタミン酸を回収する」に訂正する。

(12)訂正事項12
明細書の段落【0033】の「配列番号5の塩基配列1437-3035番目の配列を有する遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のyggB遺伝子であり、」のうち、「ATCC13032株」を「ATCC13869株」に訂正する。

2.訂正請求の適否
(1)一群の請求項について
訂正事項1?11に係る訂正前の請求項1?11について、請求項2?5は請求項1を引用し、請求項6?11はそれぞれ請求項1?5、請求項1?6、請求項1?7、請求項1?8、請求項1?9及び請求項1?10を引用するものであって、訂正事項1により訂正される請求項1に連動して訂正されるものであるから、訂正前の請求項1?11に対応する訂正後の請求項1?11は、特許法第134条の2第3項に規定する一群の請求項である。

(2)訂正事項1
訂正前の請求項1では、(ii)の置換、欠失、又は挿入されるアミノ酸の個数として「1若しくは数個」と特定していたのを「1?5個」と限定するものであるから、訂正事項1は、特許法第134条の2第1項ただし書第1号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
また、願書に添付した明細書の段落【0073】には、訂正前の請求項1に記載の「配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列のアミノ酸番号1-23、86-108、及び110-132からなる群から選ばれる領域における1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入」について、「数個の置換、欠失、付加、挿入又は逆位とは、2?20個、好ましくは2?10個、より好ましくは2?5個、さらに好ましくは2?3個を意味する」と記載されているから、訂正事項1は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第134条の2第9項で準用する同法第126条第5項に適合するものである。
さらに、訂正事項1は、yggB遺伝子における変異の際に置換されるアミノ酸の個数を限定するものであり、当該訂正により訂正前の請求項1に記載された発明のカテゴリーを変更するものではなく、かつ、訂正前の請求項1に記載された発明の対象や目的を変更するものとはならないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第134条の2第9項で準用する同法第126条第6項に適合するものである。
本件特許無効審判事件においては、すべての請求項が無効審判の請求の対象とされているので、訂正事項1に関して、特許法第134条の2第9項で読み替えて準用する同法第126条第7項の独立特許要件は適用されない。

(3)訂正事項2
訂正前の請求項2では、424位及び437位のプロリンを置換するアミノ酸として「他のアミノ酸」とあるのを、それぞれ「アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなる群から選ばれる1個のアミノ酸」及び「スレオニン、セリン及びチロシンからなる群から選ばれる1個のアミノ酸」に限定することで、特許請求の範囲を減縮しようとするものであるから、訂正事項2は、特許法第134条の2第1項ただし書第1号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
また、願書に添付した明細書の段落【0072】には、424位のプロリンを他のアミノ酸に置換する変異について「424番目のプロリンは、疎水性アミノ酸であるAla、Gly、Val、Leu、Ileに置換されることが望ましく」と記載されており、437位のプロリンを他のアミノ酸に置換する変異について「437番目のプロリンは、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸(Thr、Ser、Tyr)に置換することが望ましく」と記載されているから、訂正事項2は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第134条の2第9項で準用する同法第126条第5項に適合するものである。
訂正事項2は、yggB遺伝子における変異後のアミノ酸を限定するものであり、当該訂正により訂正前の請求項2に記載された発明のカテゴリーを変更するものではなく、かつ、訂正前の請求項2に記載された発明の対象や目的を変更するものとはならないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第134条の2第9項で準用する同法第126条第6項に適合するものである。
本件特許無効審判事件においては、すべての請求項が無効審判の請求の対象とされているので、訂正事項2に関して、特許法第134条の2第9項で読み替えて準用する同法第126条第7項の独立特許要件は適用されない。

(4)訂正事項3
訂正事項3は、訂正前の請求項3を削除するものであるから、特許法第134条の2第1項ただし書第1号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
また、訂正事項3は、請求項の削除であるから、明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第134条の2第9項で準用する同法第126条第5項に適合するものである。
さらに、訂正事項3は、請求項の削除を目的とするものであり、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第134条の2第9項で準用する同法第126条第6項に適合するものである。

(5)訂正事項4
訂正事項4は、訂正前の請求項4が訂正前の請求項1を引用する記載であったものを、請求項間の引用関係を解消し、請求項1の記載を引用しないものとし、独立請求項へ改めるための訂正であって、特許法第134条の2第1項ただし書第4号に規定する「他の請求項の記載を引用する請求項の記載を当該他の請求項の記載を引用しないものとすること」を目的とするものである。
また、訂正前の請求項4では、100位及び111位のアラニンを置換するアミノ酸として「他のアミノ酸」とあるのを、それぞれ「スレオニン」及び「スレオニンもしくはバリン」に限定することで、特許請求の範囲を減縮しようとするものであるから、訂正事項4は、特許法第134条の2第1項ただし書第1号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
また、訂正事項4は、他の請求項の記載を引用する請求項の記載を当該他の請求項の記載を引用しないものとするものであり、また、願書に添付した明細書の段落【0075】には、100位のアラニンを他のアミノ酸に置換する変異については「スレオニン残基に置換されていることが望ましい」と記載されており、願書に添付した明細書の段落【0076】には、111位のアラニンを他のアミノ酸に置換する変異について「中でも分岐鎖アミノ酸(バリン、イソロイシン、ロイシン)、特にバリン残基や、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸(スレオニン、セリン、チロシン)、特にスレオニン残基に置換されていることが望ましい」と記載されているから、訂正事項4は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第134条の2第9項で準用する同法第126条第5項に適合するものである。
さらに、訂正事項4は、yggB遺伝子における変異後のアミノ酸を限定するものであり、当該訂正により訂正前の請求項4に記載された発明のカテゴリーを変更するものではなく、かつ、訂正前の請求項4に記載された発明の対象や目的を変更するものとはならないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第134条の2第9項で準用する同法第126条第6項に適合するものである。
本件特許無効審判事件においては、すべての請求項が無効審判の請求の対象とされているので、訂正事項4に関して、特許法第134条の2第9項で読み替えて準用する同法第126条第7項の独立特許要件は適用されない。

(6)訂正事項5
訂正事項5は、訂正前の請求項5が訂正前の請求項1を引用する記載であったものを、請求項間の引用関係を解消し、請求項1の記載を引用しないものとし、独立請求項へ改めるための訂正であって、特許法第134条の2第1項ただし書第4号に規定する「他の請求項の記載を引用する請求項の記載を当該他の請求項の記載を引用しないものとすること」を目的とするものである。
また、訂正前の請求項5では、14位のロイシンと15位のトリプトファンの間に挿入されるアミノ酸の数が「1又は数アミノ酸」であるのを、「1?5アミノ酸」に限定することで、特許請求の範囲を減縮しようとするものであるから、訂正事項5は、特許法第134条の2第1項ただし書第1号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
また、訂正事項5は、他の請求項の記載を引用する請求項の記載を当該他の請求項の記載を引用しないものとするものであり、また、願書に添付した明細書の段落【0073】には、訂正前の請求項5が引用する訂正前の請求項1における(ii)に記載の変異について、「数個の置換、欠失、付加、挿入又は逆位とは、2?20個、好ましくは2?10個、より好ましくは2?5個、さらに好ましくは2?3個を意味する」と記載されているから、訂正事項5は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第134条の2第9項で準用する同法第126条第5項に適合するものである。
さらに、訂正事項5は、yggB遺伝子における変異するアミノ酸の個数を限定するものであり、当該訂正により訂正前の請求項5に記載された発明のカテゴリーを変更するものではなく、かつ、訂正前の請求項5に記載された発明の対象や目的を変更するものとはならないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第134条の2第9項で準用する同法第126条第6項に適合するものである。
本件特許無効審判事件においては、すべての請求項が無効審判の請求の対象とされているので、訂正事項5に関して、特許法第134条の2第9項で読み替えて準用する同法第126条第7項の独立特許要件は適用されない。

(7)訂正事項6?10
訂正事項6?10は、訂正前の請求項6?10が、請求項3を含む他の請求項を引用する記載であったところ、請求項3を削除したことに伴い、引用する請求項の記載を訂正するものであるから、特許法第134条の2第1項ただし書第1号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
また、訂正事項6?10は、引用する他の請求項から一部の請求項が削除されたことに伴い、引用する請求項の記載を訂正するものであるから、訂正事項6?10は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第134条の2第9項で準用する同法第126条第5項に適合するものである。
さらに、訂正事項6?10は、引用する他の請求項から一部の請求項が削除されたことに伴い、引用する請求項の記載を訂正するものであり、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第134条の2第9項で準用する同法第126条第6項に適合するものである。
本件特許無効審判事件においては、すべての請求項が無効審判の請求の対象とされているので、訂正事項6?10に関して、特許法第134条の2第9項で読み替えて準用する同法第126条第7項の独立特許要件は適用されない。

(8)訂正事項11
訂正事項11は、訂正前の請求項11が、請求項3を含む他の請求項を引用する記載であったところ、請求項3を削除したことに伴い、引用する請求項の記載を訂正するものであるから、特許法第134条の2第1項ただし書第1号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
訂正前の請求項11では、「該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体からL-グルタミン酸を回収する」とあり、「該培地中又は菌体内に」、「該培地又は菌体から」と択一的に記載されていたものから、「該培地中に」、「該培地から」に限定することで、特許請求の範囲を減縮しようとするものであるから、訂正事項11は、特許法第134条の2第1項ただし書第1号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
また、訂正事項11は、引用する他の請求項から一部の請求項が削除されたことに伴い、引用する請求項の記載を訂正するものであり、また、「該培地中又は菌体内に」、「該培地又は菌体から」との択一的記載から、「該培地中に」、「該培地から」に限定することで、特許請求の範囲を減縮しようとするものであるから、訂正事項11は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第134条の2第9項で準用する同法第126条第5項に適合するものである。
さらに、訂正事項11は、引用する他の請求項から一部の請求項が削除されたことに伴い、引用する請求項の記載を訂正するものであり、また、「該培地中又は菌体内に」、「該培地又は菌体から」と択一的に記載されていたものから、「該培地中に」、「該培地から」に限定するものであり、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第134条の2第9項で準用する同法第126条第6項に適合するものである。
本件特許無効審判事件においては、すべての請求項について無効審判の請求の対象とされているので、特許法特許法第134条の2第9項で読み替えて準用する同法第126条第7項の独立特許要件は課されない。

(9)訂正事項12
願書に最初に添付した明細書の段落【0033】には、「配列番号5の塩基配列1437-3035番目の配列を有する遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のyggB遺伝子」と記載され、また、「配列番号83の塩基配列501-2099番目の配列を有する遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のGenbank Accession No. NC_003450として登録されているゲノム配列中の塩基番号1336092-1337693にコードされており、NCgl 1221として登録されている(NP_600492. Reports small-conductance...[gi:19552490])。」と記載され、配列番号5と配列番号83の塩基配列が何れもATCC13032株の配列とされているが、両配列が重なる1437?2099番目を比較すると配列番号5と配列番号83とで一致しないので、何れかが誤記であることがわかる。
両配列とNCgl 1221の配列を比較すると、配列番号83が、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032の配列であることは明らかであるから、配列番号5がATCC13032株である旨の記載が誤記であることは明らかであり、さらに、願書に最初に添付した明細書の段落【0103】には、配列番号5のyggB遺伝子を保有するコリネバクテリウム・グルタミカムの菌株名の説明として「ATCC13869株」との記載があることから、段落【0033】に記載された配列番号5が「ATCC13032株」である旨の記載が誤記であり、正しくは、「ATCC13869株」であることは明らかである。
したがって、訂正事項12は、特許法第134条の2第1項ただし書第2号に規定する誤記又は誤訳の訂正を目的とするものである。
また、訂正事項12は、願書に最初に添付した明細書の段落【0103】に記載されている配列番号5の遺伝子を有する正しいコリネバクテリウム・グルタミカムの菌株名の記載に基づいて誤記を訂正するものであるから、願書に最初に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第134条の2第9項で準用する同法第126条第5項に適合するものである。
さらに、訂正事項12は、明細書中の誤記を訂正するためのものであるから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第134条の2第9項で準用する同法第126条第6項に適合するものである。
本件特許無効審判事件においては、すべての請求項について無効審判の請求の対象とされているので、特許法第134条の2第9項で読み替えて準用する同法第126条第7項の独立特許要件は課されない。

3.訂正請求に対する結論
以上のとおり、本件訂正は、特許法第134条の2第1項ただし書第1号、第2号及び第4号に掲げる事項を目的とするものであり、同法同条第9項で準用する同法第126条第5項及び第6項に適合するものである。
よって、本件訂正を認める。

第3 本件訂正発明
本件訂正により訂正された請求項1?2及び4?12は、訂正明細書、訂正特許請求の範囲の記載からみて、その特許請求の範囲の請求項1?2及び4?12に記載された次のとおりのものである(以下、それぞれ「本件訂正発明1」?「本件訂正発明2」及び「本件訂正発明4」?「本件訂正発明12」という。)。なお、請求項3は削除された。

「【請求項1】L-グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、
変異型yggB遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してL-グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって、
前記変異型yggB遺伝子は、(i)、(i’)、(i’’)または(ii)の変異が導入された、コリネ型細菌:
(i)配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸配列のアミノ酸番号419-533の領域もしくは配列番号62のアミノ酸番号419-529の領域の欠失、
(i’)配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸配列のアミノ酸番号419-533の領域もしくは配列番号62のアミノ酸番号419-529の領域へのインサーションシーケンス又はトランスポゾンの挿入、
(i’’)配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸配列のアミノ酸番号419-533の領域もしくは配列番号62のアミノ酸番号419-529の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異、
または
(ii)配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列のアミノ酸番号1-23、86-108、及び110-132からなる群から選ばれる領域における1?5個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入。
【請求項2】前記(i’’)の変異は、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、424位のプロリンをアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなる群から選ばれる1個のアミノ酸に置換し、及び/または437位のプロリンをスレオニン、セリン及びチロシンからなる群から選ばれる1個のアミノ酸に置換する変異である、請求項1に記載のコリネ型細菌。
【請求項3】(削除)
【請求項4】L-グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、
変異型yggB遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してL-グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって、
前記変異型yggB遺伝子の変異は、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、100位のアラニンをスレオニンに、及び/または111位のアラニンをスレオニンもしくはバリンに置換する変異である、コリネ型細菌。
【請求項5】L-グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、
変異型yggB遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してL-グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって、
前記変異型yggB遺伝子の変異は、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、14位のロイシンと15位のトリプトファンの間に1?5アミノ酸を挿入する変異である、コリネ型細菌。
【請求項6】前記変異型yggB遺伝子が、下記(a)?(n)より選ばれる変異型yggB遺伝子である請求項1、2、4及び5のいずれか一項に記載のコリネ型細菌:
(a) 配列番号8のアミノ酸配列をコードするDNA、
(b) 配列番号8のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(c) 配列番号20のアミノ酸配列をコードするDNA、
(d) 配列番号20のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(e) 配列番号22のアミノ酸配列をコードするDNA、
(f) 配列番号22のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(g) 配列番号24のアミノ酸配列をコードするDNA、
(h) 配列番号24のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(i) 配列番号64のアミノ酸配列をコードするDNA、
(j) 配列番号64のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(k) 配列番号70のアミノ酸配列をコードするDNA、
(l) 配列番号70のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(m) 配列番号74のアミノ酸配列をコードするDNA、
(n) 配列番号74のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
【請求項7】前記変異型yggB遺伝子の導入により、L-グルタミン酸アナログ耐性が向上したことを特徴とする、請求項1、2及び4?6のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項8】さらに(i)のsymA遺伝子が不活化するように改変された、請求項1、2及び4?7のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
(i) 配列番号86の塩基番号585?1121の塩基配列を含むDNA。
【請求項9】さらにα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された、請求項1、2及び4?8のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項10】コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する、請求項1、2及び4?9のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項11】請求項1、2及び4?10のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を培地で培養し、L-グルタミン酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地からL-グルタミン酸を回収することを特徴とするL-グルタミン酸の製造法。
【請求項12】下記(a)?(n)より選ばれる変異型yggB遺伝子:
(a) 配列番号8のアミノ酸配列をコードするDNA、
(b) 配列番号8のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(c) 配列番号20のアミノ酸配列をコードするDNA、
(d) 配列番号20のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(e) 配列番号22のアミノ酸配列をコードするDNA、
(f) 配列番号22のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(g) 配列番号24のアミノ酸配列をコードするDNA、
(h) 配列番号24のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(i) 配列番号64のアミノ酸配列をコードするDNA、
(j) 配列番号64のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(k) 配列番号70のアミノ酸配列をコードするDNA、
(l) 配列番号70のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(m) 配列番号74のアミノ酸配列をコードするDNA、
(n) 配列番号74のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。」

第4 当事者の主張の概要
1.請求人の主張
請求人は、本件特許第5343303号を無効とする、審判費用は被請求人の負担とする、との審決を求め、以下のように主張したが、平成30年5月22日付け口頭審理陳述要領書において無効理由1及び2を取り下げたので、審理の対象となるのは無効理由3、4、5及び6である。

(無効理由1)本件特許の請求項1、3、7、10?11に係る発明は、甲第26号証に記載された発明であるから、特許法第29条第1項第3号の規定により特許を受けることができないものである。

(無効理由2)本件特許の請求項7、9に係る発明は、甲第26号証または甲第26号証及び甲第2号証に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法第29条第2項の規定により特許を受けることができないものである。

(無効理由3)本件訂正発明1、4、6?7、9?12は、甲第8号証、甲第2号証、甲第10号証、甲第13号証、甲第14号証及び甲第15号証等に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法第29条第2項の規定により特許を受けることができないものである。

(無効理由4)本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明1?2、4?7、10?12の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているとはいえないから、本件発明の詳細な説明の記載は、特許法第36条第4項第1号に規定する要件を満たしていないものである。

(無効理由5)本件訂正発明1?2、4?7、10?12は、発明の詳細な説明に記載されたものとはいえないから、本件特許請求の範囲の記載は、特許法第36条第6項第1号に規定する要件を満たしていないものである。

(無効理由6)本件訂正発明6?12は、明確に記載されているとはいえないから、本件特許請求の範囲の記載は、特許法第36条第6項第2号に規定する要件を満たしていないものである。

そして、請求人が提出した証拠方法は、以下のとおりである。
甲第1号証:特許第5343303号公報
甲第2号証:国際公開第95/34672号
甲第3号証:特開昭61-268185号公報
甲第4号証:特開昭62-201585号公報
甲第5号証:化学大辞典(縮刷版第32刷)(1989)p.268-271
甲第6号証:生化学辞典(第3版)(1998)p.858
甲第7号証:Protein Eng.(2002)15(1),p.29-33
甲第8号証:Eur.J.Biochem.(1997)247,p.572-580
甲第9号証:J.Biol.Chem.(2002)277(31),p.27682-27688
甲第10号証:FEMS Microbiol.Lett.(2003),218,p.305-309
甲第11号証:Nucleotide, The National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1019251?report=full_report&format=text)
甲第12号証:Metabolic Eng.(1999)1,p.255-261
甲第13号証:Science(2002)298(22),p.1582-1587
甲第14号証:EMBO J.(2003)22(1),p.36-46
甲第15号証:Biophysical J.(2004.Nov.)87,p.3050-3065
甲第16号証:Clustalw Result (http://www.genome.jp/tools/clustalw/)Cgl1270と,本件特許の配列番号84及び85とのアミノ酸配列のアラインメント
甲第17号証:特表2002-508921号公報
甲第18号証:特開昭62-166890号公報
甲第19号証:特開昭63-214189号公報
甲第20号証:特開2004-313202号公報
甲第21号証:Appl.Microbiol.Biotech.(1986)25,p.220-223
甲第22号証:Biotech.Bioeng.(1996)51,p.40-50
甲第23号証:Appl.Env.Microbiol.(1996),62(12),p.4345-4351
甲第24号証:Appl.Env.Microbiol.(1994)60(1),p.126-132
甲第25号証の1:国際公開第2003/046123号
甲第25号証の2:米国特許出願公開第2005/0003494号明細書
甲第26号証:欧州特許出願公開第1108790号明細書
甲第27号証:Clustalw Result (http://www.genome.jp/tools/clustalw/)甲第26号証の配列番号4901と本件特許の配列番号84及び85とのアミノ酸配列のアラインメント
甲第28号証:実験報告書
甲第29号証:生化学辞典(第3版)(1998)p.1217
甲第30号証:特開昭63-214189号公報
甲第31号証:Clustalw Result (http://ww.genome.jp/tools/clustalw/)Cg11270によりコードされるアミノ酸配列と配列番号22及び配列番号24のアミノ酸配列のアライメント
甲第32号証:Clustalw Result (http://ww.genome.jp/tools/clustalw/)大腸菌由来yggB及びコリネ型細菌由来yggBのTM3領域のアミノ酸配列のアライメント
甲第33号証:Clustalw Result (http://ww.genome.jp/tools/clustalw/)本件特許の配列番号84及び配列番号6とのアミノ酸配列のアライメント
甲第34号証:実験報告書
甲第35号証:J.Biol.Sci.(2002)2(3),p.151-156

2.被請求人の主張
被請求人は、本件無効審判請求は成り立たない、審判費用は請求人の負担とする、との審決を求め、請求人の主張する無効理由及び証拠によっては、本件訂正発明を無効にすることはできないと主張した。

そして、被請求人の提出した証拠方法は以下のとおりである。
乙第1号証:Biosci.Biotechnol.Biochem.(2013)77(5),p.1008-1013
乙第2号証:化学と生物(2012)50(6),p.441-449
乙第3号証:中森茂著「アミノ酸発酵技術の系統化調査」『技術の系統化調査報告 第11集』(独立行政法人国立科学博物館産業技術史資料情報センター編集)(2008)p.58、66、74
乙第4号証:J.Appl.Environ.Microbiol.(2007)73(14),p.4491-4498
乙第5号証:J.Ind.Microbiol.Biotechnol.(2002)28(6),p.333-337
乙第6号証:実験成績証明書「C.glutamicum ATCC13869-19のグルタミン酸生産能の評価、および19型YggB変異の評価」
乙第7号証:真野佳博=川向誠編著『ポイントがわかる分子生物学第2版』(2010年)p.2-3、18-19
乙第8号証:社団法人日本化学会編『標準化学用語辞典』(1998)p.571
乙第9号証:日本光合成学会のウェブサイトの光合成事典の「グリシンベタイン」の項のプリントアウト(http://photosyn.jp/pwiki/index.php?%E3%82%B0%E3%83%AA%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%83%99%E3%82%BF%E3%82%A4%E3%83%B3)
乙第10号証:相川直樹ら編集『医学大辞典19版』(2006)p.641
乙第11号証:『14906の化学商品』(2006)p.1614、1645
乙第12号証:「第III部第2章第4節 特定の表現を有する請求項等についての取扱い」『特許・実用新案審査基準』p.1-2
乙第13号証:日本農芸化学会誌(1949)23(10),p.426-429
乙第14号証:P.F.Stanbury,A.Whitaker著『発酵工学の基礎』(1992)p.169-172、189-190
乙第15号証:相田浩ら編『アミノ酸発酵』、明石邦彦ら著「1.酸素及び炭酸ガスの効果」(1986)p.127-144
乙第16号証:東京大学農学部農芸化学教室編『実験農芸化学下第3版』(1980)p.201-203
乙第17号証:「坂口フラスコと振盪培養機」と題した有限会社いわしやバイオサイエンスのウェブサイトのプリントアウト(http://www.iwashiyabio.com/newpage03.html)
乙第18号証:「容器形状や振とうの速度・振幅と培養効率について」と題したタイテック株式会社のウェブサイトのプリントアウト(https://taitec. net/wp-content/uploads/2017/05/ADS025_BRs_04_K01.pdf)
乙第19号証:Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83(4),p.917-921
乙第20号証:『南山堂 医学大辞典』(2008)p.1851、2280
乙第21号証:G.E.Schulz,R.H.Scirmer共著『タンパク質 構造・機能・進化』(1987)p.19-29
乙第22号証の1:「第2章生命の化学的基礎」と題した東京医科歯科大学のウェブサイトのプリントアウト(http://www.tmd.ac.jp/artsci/biol/textintro/Chapt2.htm#top)
乙第22号証の2:「生物学基礎」と題した東京医科歯科大学のウェブサイトのプリントアウト(http://www.tmd.ac.jp/artsci/biol/textintro/introtop.htm)
乙第23号証:宮田隆著「分子進化学の基礎」物性研究(2003)81(1),p.53-59
乙第24号証:「アミノ酸の製法について」と題した被請求人ウェブサイトのプリントアウト(https//www.ajinomoto.co.jp/amino/manabou/seihou.html)
乙第25号証:岡田弘著『グルタミン酸製造技術の変遷』化学工業(1984)p.76-81
乙第26号証:特許第6196034号公報

第5 甲号証の記載事項
甲第8、2?4、7、9?10、12?15、17?24号証、甲第25号証の1、甲第30、35号証には、以下の事項が記載されている(英語で記載されている証拠は、日本語訳で摘記する。)。

1.甲第8号証
(甲8-1)「細菌は、低浸透圧ストレスに対して、低分子量の溶質を遊離し、一定の膨脹圧を維持することによって応答する。我々は、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて、浸透圧の突然の低下による様々な溶質の排出に関わる、浸透圧調節チャネルの機能を研究している。当該チャネルは、グリシンベタイン及びプロリンのような相溶性の溶質の排出を優先的に媒介する。同じような大きさの分子、例えば、グルタミン酸又はリジンの遊離は、制限され、ATPは、厳しい浸透圧ショックの後であっても、完全に維持された。」(第572頁、要約第1行?第6行)

(甲8-2)「これらの結果は、大腸菌のメカノセンシティブチャネルに類似の浸透圧調節チャネルが、C.グルタミカムに存在することを示唆する。」(第572頁、要約第13行?第14行)

(甲8-3)「表1.C.グルタミカムでの低浸透圧ショック後の溶質排出の特異性。標識又は非標識の相溶性の溶質(グリシンベタイン、プロリン、エクトイン)の蓄積により、あるいはジペプチド(リジン、アラニン)の添加により、高浸透圧条件下(それぞれ1860mOsm及び2100mOsm)で細胞を溶質に負荷した。細胞は、表に示したように希釈した。シリコンオイルの上清及びペレットにおける低浸透圧ショックの1分後、シンチレーションカウンティング(sc.count.)、HPLC、酵素アッセイ、NMR、ルシフェリン/ルシフェラーゼアッセイ、又はフレームフォトメトリー(flame ph.)を用いて排出を測定した。値はμmol・mgdm^(-1)で示す、なぜなら、変化した細胞質体積に基づく真の内部濃度への補正は、総変化の結果のミスリーディングを起こすためである。すべての値は、少なくとも3回の実験の平均である。等モル希釈及び540mOsmに対する低浸透圧ショックのそれぞれに関し、残存した溶質の相対値を示す。

^(a)グリシンベタイン(3mM)及びエクトイン(3mM)を同時に負荷。
^(b)ATPの排出は、細胞質のATP総量の2%を超えなかった。
^(c)Na^(+)及びK^(+)の場合、浸透圧のステップは2100、1140、820、420mOsmとした。
^(d)2mMグリシンペタインの存在下で負荷し、競合状態を作出(本文を参照)。」(第575頁、表1)

(甲8-4)「土壌細菌として、C.グルタミカムは、頻繁に起こる緊急事態、即ち、低浸透圧ショックに対して応答する効率的なメカニズムを装備している。浸透圧変化に由来する膜に作用する機械的ストレスは、細胞サイズの有意な変化を定量することにより明らかにされた。我々が研究してきた排出システムは、大腸菌及びL.プランタルムにおいて以前記載したメカノセンシティブチャネル(Berrierら、1992;Schleverら、1993;Glaaskerら、1996)と定性的に類似する方法で低浸透圧ショックに応答する。しかしながら、C.グルタミカムのチャネルは、運搬の特異性と排出活性の制御に関して、いくつかの特異的性質を示す。」(第578頁左欄第37行?第49行)

(甲8-5)「非特異的チャネル阻害剤Gd3^(+)に対するこのチャネルの感受性の欠如は(Berrierら、1992;Schleverら、1993;Haseら、1995)、大腸菌において記載されクローン化されたGd^(3+)感受性MscLチャネルとは異なるものとして、それをさらに定義する(Sukharevら、1994)。しかしながら、この非特異的遮蔽剤が作用しないその他の例も存在する(Berrierら、1996)。したがって、C.グルタミカムのチャネルは、電気生理学的技術を用いることにより大腸菌において同定されたその他のタイプ、即ち、MscSと類似するかもしれない(Martinacら、1987、1990;ZorattiとPetronilli、1988;Berrierら、、1996)。」(第578頁右欄第46行?第55行)

2.甲第2号証
(甲2-1)「α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損したコリネ型L-グルタミン酸生産菌、この細菌を用いたL-グルタミン酸の製造法、及びコリネ型L-グルタミン酸生産菌に由来するα-KGDH活性を有する酵素をコードする遺伝子、この遺伝子を含む組換えDNA、この組換えDNAを保持するコリネ型細菌、及び前記組換えDNAを保持し、L-リジン生産能を有する細菌を用いたL-リジンの製造法を開示する。」(要約)

(甲2-2)「従来よりL-グルタミン酸はブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いた発酵法により工業的に生産されている。」(第1頁第13行?第14行)

(甲2-3)「コリネ型L一グルタミン酸生産菌のα?KGDΗ活性のレベルがL-グルタミン酸の発酵生産に影響を及ぼすことが明らかとなった。従って、薬剤遺伝子の挿入等によるα?KGDH遺伝子活性欠失株の取得、in vitro変異による活性弱化株の取得、プロモーターの改変による発現低下株の取得等により、従来のコリネ型L一グルタミン酸生産菌と比較してさらにL?グルタミン酸生産能が向上した菌株を効率よく育種することが可能となる。」(第33頁下から第6行?最終行)

(甲2-4)「2.請求項1記載のコリネ型L-グルタミン酸生産菌を液体培地中に培養し、培養液中にL-グルタミン酸を生成蓄積させ、これを採取することを特徴とするL-グルタミン酸の製造法。」(請求項2)

3.甲第3号証
(甲3-1)「グルタミン酸生産性コリネ型細菌は、大量にL-グルタミン酸を生産することが知られている。」(第2頁右上欄第8行?第10行)

(甲3-2)「工業的に有用なグルタミン酸生産性コリネ型細菌に所望の物質を大量に効率よく生産させるために、その細菌のDNA組換え技術による育種改良が試みられている。」(第2頁右上欄第14行?第17行)

4.甲第4号証
(甲4-1)「グルタミン酸生産性コリネ型細菌は、大量にL-グルタミン酸を生産することが知られている。」(第2頁右上欄第8行?第9行)

(甲4-2)「工業的に有用なグルタミン酸生産性コリネ型細菌について、DNA組換技術による育種改良が試みられている。」(第2頁右上欄第14行?第16行)

5.甲第7号証
(甲7-1)「エタノールの産業的生産(例えば、醸造、燃料エタノール生産)において、澱粉の発酵可能な糖への変換は、典型的に65-73℃で起こるため、α?グルコシダーゼの熱安定性は重要である。本件研究では、我々は、4つの植物種由来のα?グルコシダーゼの熱安定性を調査し、それらの推定アミノ酸配列を比較し、そして、野生型酵素に存在する残基のプロリンへの置換による、α-グルコシダーゼの熱安定性への影響を試験した。大麦(Hordeum vulgare)由来のα-グルコシダーゼは、その他3つのα-グルコシダーゼよりも顕著に熱に不安定であった。これら4つのα-グルコシダーゼの公開された推定アミノ酸配列の比較により、大麦の酵素には見られない、最も熱に安定な3つのα-グルコシダーゼにおいて保存されたプロリン残基を明らかにした。部位特異的変異を組換え大麦α-グルコシダーゼに行い、これらの保存された位置でプロリンを有するタンパク質を作成した。これらの変異タンパク質の一つ、T340Pの熱安定性(T_(50))は、非変異酵素より10℃高かった。」(第29頁、要約)

(甲7-2)「

図3.pH6.0での、組換え大麦α-グルコシダーゼ(rAGL,四角)、T340P変異酵素(三角)、及びA742P変異酵素(円)の活性における温度の影響。0?60℃の範囲の温度、pH6で、rAGL、T340P、及びA742Pを10分インキュベートした。マルトース加水分解の残存速度を、18時間、30℃、pH4.5でアッセイした。残存活性は、非加熱のコントロールのパーセントに基づく(rAGL=0.7nmol/min/ml、T340P酵素=0.9nmo1/min/ml、A742P酵素=1.65nmo1/min/ml。」(第31頁、図3)

(甲7-3)「プロリン残基は熱安定性に重要なため(Matthewsら、1987;Suzukiら、1989)、組換え大麦α-グルコシダーゼにおいて変異を行い、より熱に安定なα-グルコシダーゼに存在する位置にプロリン残基を挿入した。変異を行い、336、340、及び742の位置ヘプロリンを追加した。T340P及びA742Pはα-グルコシダーゼ活性を有する一方、336の位置での変異(R336P)は、不活性なタンパク質をもたらした(データは示さず)。
Garnierらの理論(Garnierら、1978)に基づくペプチド構造プログラム(ウィスコンシンGCGパッケージ、ウィスコンシン、マディソン郡)を用いて行った二次構造の推定は、この残基をβ-シートの中に置いたため(表1)、547の位置では変異を行わなかった。Watanabeらによれば、β-シートの中にプロリン残基を挿入すると、酵素の熱安定性は増強されない(Watanabeら、1991)。
野生型組換え大麦α-グルコシダーゼ(rAGL)、並びにT340P及びA742P変異酵素の熱安定性プロフィル(pH6)は、図3に示される。図3に示される、粗抽出物に由来するrAGLの熱安定性プロフィルは、Muslinらにより以前に公開された精製rAGLの熱安定性プロフィル(Muslinら、2000)とほぼ同一であった。実際に、T_(50)は、粗酵素で47.8℃、精製酵素で47.6℃であった。従って、我々は、本研究で使用するいずれの酵素抽出物は精製を要しないと結論した。A742P酵素は、20℃のT_(50)を有し、そして40℃への曝露後は完全に不活性であった。これに対し、T340P酵素は、最も高い熱安定性を示し、50℃より高い温度に加熱されるまで活性を低下させなかった。」(第31頁左欄第6行?右欄第4行)

6.甲第9号証
(甲9-1)「本質的に、すべての生物は機械的な力を検知する。バランス感覚、触覚、及び聴覚は、この能力に依存するヒトでのいくつかのシステムである。微生物も、細胞性エンベロープを介する浸透グラジエントに由来する力を検出しているはずである。これらのシステムの本質的にすべての電気生理学的研究は、これらの力を感知する最も主要なメカニズムの一つとして、メカノセンシティブ(MS)チャネルを示唆している(MSチャネルのレビューに関し、Ref.1を参照)。」(第27682頁左欄第26行?第34行)

7.甲第10号証
(甲10-1)「コリネバクテリウム・グルタミカム遺伝子配列におけるデータベースサーチは、大腸菌のメカノセンシティブチャネル、MscL及びyggBのホモログを明らかにした。これら推定チャネルの生理的役割を解明するために、欠損変異体を構築した。mscL欠失変異体の浸透圧ダウンショックにより誘導されたベタイン排出は、野生型のそれとほとんど同じであったー方、yggB欠失変異体は排出速度を低下させた。興味深いことに、ベタイン排出能がより一層の低下することが期待された二重欠損株は、野生型と比較してわずかに減少した排出速度を有するのみであり、浸透圧ダウンシフト後の死滅率を増加させなかった。これらの結果は、C.グルタミカムは、MscLやYggB/KefAファミリーと関係しない、第3のタイプのメカノセンシティブチャネルを有するかもしれないという仮説を導く。更に、二重欠損変異体において検出された高い運搬能のため、MscM様の活性はベタイン排出に関わりがありそうにない。」(第305頁、要約)

(甲10-2)「細胞が外部浸透圧の急激な低下に曝されると、水の流入が膨脹圧の増加を引き起こし、細胞が破壊され得る。応答として、細胞質の溶質がメカノセンシティブチャネルを介して放出され、膨脹圧の急激な低下が達成される。異なる大きさ及び伝導度のメカノセンシティブチャネルの活性は、グラム陰性及びグラム陽性細菌において示された。少なくとも三つのサブファミリー、MscL、MscS、及びMscMが大腸菌で同定された。」(第305頁左欄第12行?右欄第2行)

(甲10-3)「2.6.アクセション番号
C.グルタミカムのゲノムデータベース(http://gib.genes.nig.ac.jp)におけるのmscL及びyggBのオープンリーディングフレーム(ORF)の番号は、それぞれ、Cg10879及びCg11270である。」(第307頁左欄第8行?第11行)

(甲10-4)「これらは、それぞれ大腸菌のmscL及びyggBに類似する2つのオープンリーディングフレームを明らかにした。MscLホモログ(135アミノ酸残基)は、結核菌のMscLと57%同じアミノ酸を共有し、そして大腸菌のMscLと38%同じアミノ酸を共有し、更にMscLファミリーの典型的な構造的特徴を有する。YggBホモログは、533アミノ酸を有し、大腸菌のyggB、2つのタンパク質の内部のみで29%同一アミノ酸が見いだされた、よりも、様々なミコール酸含有放線菌の対応するホモログに対してより高い相同性を示す(?36%同一)。」(第307頁左欄第19行?第30行)

(甲10-5)「

図1.15秒(閉じたシンボル、実線)及び60秒(オープンシンボル、ドット線)後のダウンショックの程度に対する、排出されたベクイン量の依存性。示された浸透圧のバッファーに懸濁する前に、放射標識したベタインに細胞を前もって負荷した。A:野生型;B:Cg△mscL;C:Cg△yggB;及びD:Cg△mscLAyggB。破線は15秒(Aのグラフのリニアフィット)後の野生型の排出速度を表す。」(第308頁、図1)

8.甲第12号証
(甲12-1)「今回の結果によると、グルタミン酸の排出は、C.グルタミカム2262におけるグルタミン酸の過剰生産のための主要な動力学的ボトルネックと考えることができる。遺伝の報告では、アミノ酸の排出は、C.グルタミカムでのリジン(Ke11eら、1996)、イソロイシン(Morbachら、1996)、及びスレオニン(Reinscheidら、1994)生産のための可能性のある律速ステップとしても推測された。結論として、株又はプロセスの改善に向けられた将来の研究は、細胞のアミノ酸排出能をさらなる増強、ひいてはグルタミン酸の内部蓄積の低減を特に目的とすべきである。」(第260頁右欄第24行?第34行)

9.甲第13号証
(甲13-1)「MscSチャネル、yggBをコードする遺伝子は、Boothとその共同研究者により同定された;」(1582頁第1欄第25行?第27行)

(甲13-2)「MscSにおけるAla^(106)に相当する、ホモログタンパク質KefAにおける922番目の位置での変異は、圧力に対してより感受性であるチャネルを形成し、カリウムに対して超過敏の細胞を形成することが報告されており、チャネルのこの領域の機能的な重要性を強調している。」(第1583頁第3欄第15行?第1584頁第1欄第2行)

(甲13-3)「メカノセンシティビティー。メカノセンシティブチャンネルを同定することにおけるチャレンジの一部に、メカノセンシティビティーに関わる明確な配列モチーフがないことがある;これらチャネルの多様性は、MscSとMscLの構造的相同性の欠如によりさらに強調される。しかしながら、yggB(8)の分析で指摘されるように、両タンパク質での特定の膜貫通ヘリックスは、第4の残基ごとに存在する傾向にある、小さな(Gly及びA1a)保存された残基のパターンを示す。これらの残基、特にG1yは、ヘリックスーヘリックスパッキング相互作用((36)を参照)に関与し、そして、MscS及びMscLの構造において、それらはポア形成ヘリックスのインターフェース部位で発見された。これらのチャネルは、高いコンダクタンス特性を示し、そして、これは、それらの両方とも、MscLで提案されたように(15、18)、クローズ状態とオープン状態の間で、ポア領域において相当なコンフォメーションの再配列を受けることが示唆される。結果として、ポアのヘリックス間のインターフェースでの残基は、クローズ状態及びオープン状態のいずれにおいても、ヘリックスーパッキング相互作用に互換性があるはずである。小さいアミノ酸、特にG1y及びA1aは、これらの位置で、コンダクタンス状態間の相互変換を促進し、よって、これら高コンダクタンス、メカノセンシティブチャネルの特徴かもしれない(37)。」(第1586頁第2欄第22行?第3欄第10行)

10.甲第14号証
(甲14-1)「大腸菌MscSメカノセンシティブチャネルタンパク質の主な構造的特徴を、アルカリホスファターゼ(PhoA)融合、正確な欠損及び部位特異的変異を用いて調査した。PhoAタンパク質融合データは、ポジティブ-インサイド則と組み合わせて、MscSが膜を3回横断し、N_(out)-C_(in)構造をとっているというモデルを強く支持する。欠損データは、タンパク質のC末端ドメインは、MscSチャネルの安定性に必須であり、一方、タンパク質はN末端での小さな欠失を寛容するであろうことを示唆する。ゲイン・オブ・ファンクション(GOF)又はロス・オブ・ファンクションのいずれかを示す4つの変異体が同定された:二重変異体I48D/S49PはMscSを不活性化し、一方、MscS変異体T93R、A102P、及びL109Sは強力なGOF表現型を引き起こした。ダウンショック生存アッセイにおいて欠失されたMscKタンパク質の発現がMscL及びMscSに置換できるという証拠により、MscK(以前はKefA)の少なくとも2つのドメインに対するMscSの類似は強化される。機構、保存、及び変異体の影響に関する研究に由来するデータは、MscSチャネルの構造における有意な洞察を提供する。」(第36頁、要約)

(甲14-2)「大腸菌では、MSチャネル活性の3つの認識されたグループが存在し、それらは、電気的伝導度及び活性化のための圧力闇値に基づいて定義される:MscM、低圧力により開かれる低(小)チャネル;MscS、中程度の圧力により開かれる?1nSチャネル;MscL、高い伝導度を示し、非常に高い膜張力でのみ開く(B1ountら、1999;Sukharev、1999)。」(第36頁右欄第5行?第12行)

(甲14-3)「電気生理学的分析により検出された大腸菌のMscS活性は、KefAとYggBの合計である(Levinaら、1999)。YggBタンパク質は、脂質ベシクルにおいて単独で再構成され、MscSと同じ伝導度で機能的チャネルを形成することが示された(Okadaら、2002;Sukharev、2002)。これに基づいて、YggBはMscSに改名すべきであること、そして、類似の伝導度を有するがK^(+)と特異的な相互作用を有するKefAはMscKと呼ぶべきであることが提案された(Liら、2002)。」(第36頁右欄第37行?第45行)

(甲14-4)「

MscSタンパク質の機構。(A)DNASTARに適合されたプログラムを用いて作成された大腸菌MscSタンパク質の疎水性プロット(w=19残基)。

(D)PhoAデータに基づくMscSタンパク質の提案されたトポロジー。シンボル:十、プラスにチャージしたアミノ酸;影を付けた円、提案されたペリプラスムに位置する残基94。」(第37頁、図1A、図1D)

(甲14-5)「これらのデータは、pMscSH6からの非誘導発現に関わる低い濃度で発現させた場合であっても、A102P変異が強いGOF表現型を引き起こすことを示唆する。」(第41頁左欄第25行?第28行)

(甲14-6)「最近、B1ountとその同僚は、類似の形質を示した残基40でのMscSのGOF変異体を単離し、この残基はMscSにおいて類似の「ロッキング」の役割を果たすことを提案した(Okadaら、2002)。V40K及びV4ODの置換のみが、有意なGOF表現型を引き起こした。その他の変化、中程度に親水性の残基への変化並びにグリシンへの変化でさえも、寛容された。この研究では、我々は、三つの新たなMscSGOFアレル、T93R、L109S、及びA102Pを同定し、これらはペリプラスミックループ及びTMS3に存在する。」(第43頁左欄第19行?第28行)

11.甲第15号証
(甲15-1)「周囲環境の様々な刺激に対して保護及び反応する能力は、すべての生物にとり必須である。音、重力、又は浸透圧により発生する機械的な力は、その他の刺激の中で、メカノセンシティブイオンチャネルを含む様々なメカニズムを介して生物により感知される(HamillとMartinac、2001;SukharevとCorey、2004)。これらの膜タンパク質は、機械的刺激の適用により開閉し、したがって、実質的に電気的シグナル(メカノトランスダクション)になる、或いは、単純に、例えば、浸透圧に対する細胞体積の制御又は適合に役立つイオン電流を形成する。」(第3050頁左欄第2行?第13行)

(甲15-2)「

図1.MscSのホモヘプタマー構造。(A)MscS結晶構造のカートゥーン表示。各サブユニットは、異なる色で示される。示唆される膜の位置(Bassら、2002)は影付きのバーとして示される。(B)7量体構造のサブユニットB。このサブユニットは、カートゥーンとリボン表記で示される。膜貫通ドメインは3つのヘリックス(TM1、TM2、及びTM3A-TM3B)及びより大きな細胞質ドメインにより形成される。TM3A-TM3Bヘリックスは、残基Gly^(113)で顕著にねじれ、膜の細胞質側でポアの最も狭い部分に近づく。(C)サーフェス及びチューブ表示において示される2つのモノマーの膜貫通ヘリックス。チャージした残基は、空間充填表記で示され、青(+)及び赤(-)で示される。Leu^(105)及びLeu^(109)の位置(空間充填表記により描かれる)は、矢印で示される。(D)膜貫通ドメインのトップビュー(残基27-128)。ポア残基(96-113)は、サーフェス表記において示される。各サブユニットは、色と文字でラベルされる。1つのサブユニットのTM3Bヘリックスは、隣のサブユニットのTM1及びTM2の間のループのちょうど下に位置する。(E)MscSのサーフェス表記。側面に位置し、底で一つになる7つの細胞質のオープニング。」(第3051頁、図1)

(甲15-3)「ランダム変異実験は、いくつかの機能的に関連する残基を同定した。二重変異I48D/S49P(両残基とも、TM1の細胞質側に位置する、図1B)はチャネルを不活性化し、一方、T93R、L109S、A102P、V40K、及びV40Dは、ゲイン・オブ・ファンクション表現型として同定された(Millerら、2003a;Okadaら、2002)。93、102、及び109の残基がチャネルの伝導特性に影響を与えることは驚くことではないなぜなら、それらはポアを内張りするヘリックス(図1のTM3A)に位置するからである。」(第3051頁右欄第3行?第3052頁左欄第1行)

(甲15-4)「

図6.(A)ポアの閉鎖によるTM3A変形の詳細。サブユニットCヘリックス(残基96-113)のバックボーンは、チューブ表記で示される。残基Gly101、Ala102、Leu105、及びA1a106は、リコリス表記で示される。水素結合は、青で示される。(左)シミュレーションsim1の終わり(4.45ns)でのスナップショット。(右)シミュレーションsim2aのt=6.04nsでのスナップショット。(B)ポア残基(96-113、TM3A)及び周囲の脂質(ファンデルワールス表記、水素原子を白、炭素原子をシアン、そして酸素原子を赤とする)。サブユニットを図1Dのように着色した。各サブユニットの残基Leu105は、空間充填表記で示される。サブユニットA(明るい青)、C(赤)、及びE(オレンジ)は、顕著なねじれを示し、それらのLeu105側鎖はポアを遮蔽する。サブユニットAは脂質と密接する一方で、その他のサブユニットは密接しない。」(第3055頁、図6)

12.甲第17号証
(甲17-1)「【0002】
アミノ酸は、産業上極めて重要であり、アミノ酸の使用は多様である:すなわちたとえばL-リジン、たとえばL-スレオニン、L-メチオニン及びL-トリプトファンは飼料添加物として、L-グルタミン酸(Glutamat)は調味料として、L-イソロイシン及びL-チロシンは医薬業界で、L-アルギニン及びL-イソロイシンは薬剤として、あるいはL-グルタミン酸、L-アスパラギン酸(Asparat)及びL-フエニルアラニンはファインケミカルズの合成用出発化合物として必要とされる。
【0003】
この種々のアミノ酸製造の好ましい方法は、微生物によるバイオテクノロジー法である。というのはこの方法で各アミノ酸の生物学的に有効かつ光学的に活性な形が直ちに得られ、簡単かつ価格上有利な未精製物質を使用することができるからである。微生物としてたとえばコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)及びその同属菌ssp.フラブム(flavum)及びssp.ラクトフェルメンタム(lactofermentum)(Liebel 等、Int J System Bacteriol(1991)41:255-260) 及びエシェリキア・コリ(大腸菌)(Escherichia coli)及びその同属菌が使用される。
【0004】
しかしこの菌は、一般にアミノ酸を増殖に必要な量でしか産生しないので、過剰のアミノ酸は産生されず、分離もされない。これは細胞内でアミノ酸の生合成が簡単な方法で調節されるということに基づく。したがって生成物産生をコントロールメカニズムの遮断によって増加させる種々の方法はすでに公知である。この方法に於ては、たとえばアミノ酸相似体を、生合成の有効な調節を遮断するために使用する。したがってたとえばL-チロシン- 及びL-フエニルアラニン相似体に耐性であるコリネバクテリウム菌株を使用する方法が開示されている(特開昭51-19037号及び同53-39517号公報)。同様にL-リジン- 又はL-スレオニン相似体に耐性の細菌がコントロールメカニズムを阻害するために使用されることが記載されている(ヨーロッパ特許第0205849号明細書、英国特許第2152509号明細書)。」(段落【0002】?【0004】)

13.甲第18号証
(甲18-1)「グルタミン酸生産性コリネ型細菌は、大量にL-グルタミン酸を生産することが知られている。」(第2頁左上欄第14行?第16行)

14.甲第19号証
(甲19-1)「L-グルタミン酸は調味料として幅広い用途があり、グルタミン酸生産性コリネ型細菌を培養して該細菌にL-グルタミン酸を生産せしめ、生成するL-グルタミン酸を該細菌の培養物から分離する発酵法により工業的に生産されている。」(第2頁左下欄第10行?第14行)

(甲19-2)「これらの細菌を用いてグルタミン酸を製造する際には、発酵終了時のL-グルタミン酸の培地中への蓄積濃度を高めること、および使用原料(W)当りのグルタミン酸の生成量(対糖収率)を向上させることが工業的に重要である。上記目的を達成するために、生産菌の育種改良が種々検討されている.たとえば、グルタミン酸のアナログ(構造類似体)またはグルタミン酸生合成経路の各種中間体のアナログ等に耐性を示す菌株を作製することにより、各種酵素活性のフィードバック阻害や抑制の解除された菌株を育種する方法.またグルタミン酸生合成経路の途中より分岐して副生産物の合成に向かう経路の酵素活性の低下した菌株を育種する方法等が試みられている。一方、グルタミン酸生合成に関与する酵素の活性を強化することによりL-グルタミン酸の生産速度を高めるとともに効率良くL-グルタミン酸を生成させる試みも近年行われるようになり、この目的省達成するためにグルタミン酸の生合成経路に関与する各種酵素遺伝子のクローニングが行われつつある.」(第2頁左下欄第19行?右下欄第19行)

(甲19-3)「しかしながら、L-グルタミン酸発酵においてその生産性を十分向上することのできる菌株については、これまでに報告された例がなかった。」(第3頁右上欄第5行?第7行)

15.甲第20号証
(甲20-1)「【0006】
本発明は、プラスミドを用いることなく目的遺伝子の発現量の適度な強化および調節を行うことができ、アミノ酸を高収率で生産する能力を有する変異株を遺伝子組換え又は変異により構築する方法を提供することを目的とする。
本発明は、副生アスパラギン酸およびアラニンの著しい増加を引き起こすことなく、コリネバクテリア菌株にグルタミン酸を高収率で生産する能力を付与することができるGDH用プロモーターを提供することを目的とする。
本発明は、又、上記GDH用プロモーター配列を持つGDH遺伝子を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記遺伝子を有するL-グルタミン酸生産性コリネバクテリア菌株を提供することを目的とする。
本発明は、構築されたアミノ酸生産菌を用いる醗酵法によるアミノ酸の製造法を提供することを目的とする。
本発明は、コリネ型グルタミン酸生産菌を用いる、グルタミン酸の収率を向上させ、より安価にグルタミン酸を製造するグルタミン酸発酵法を提供することを目的とする。」(段落【0006】)

16.甲第21号証
(甲21-1)「本研究では、我々は、フェドバッチ発酵でのコリネバクテリウム・グルタミカムによるグルタミン酸の生産を試験した。対数増殖期に、2種の界面活性剤を非常に正確なステップで添加することによって、アミノ酸の排出を誘導した。界面活性剤のいくつかの効果を報告し、そして排出の誘発におけるそれらの役割を議論する。高濃度又は低濃度の排出されたグルタミン酸のいずれかをもたらす様々な条件での発酵における、細胞内と細胞培地間のグルタミン酸の再分配を我々は観察した。グルタミン酸の細胞内濃度を測定し、生理的状態の変化を反映する細胞容積の変化を考慮した。」(第220頁左欄第31行?右欄第11行)

17.甲第22号証
(甲22-1)「生合成経路と反応エンジニアリングの最適化における進んだ状態との比較において、アミノ酸の過剰生産における重要なステップ:生産物の発酵培地への排出、に向けられた研究は比較的少数である。」(第40頁左欄第41行?右欄第2行)

18.甲第23号証
(甲23-1)「したがって、高濃度のL-イソロイシン生産菌SM13において、このアミノ酸の外部への輸送は、主要な律速反応ステップであり、ゆえに、生物工学の目的のための菌株設計の新しいターゲットである。」(第4345頁、要約第13行?第15行)

19.甲第24号証
(甲24-1)「これらの結果は、C.グルタミカムを用いるスレオニン生産は、このアミノ酸の排出システムにより制限されることが示唆される。」(第126頁、要約第14行?第15行)

20.甲第25号証の1
(甲25の1-1)「

」(第55頁、表1)

21.甲第30号証
(甲30-1)「これらの細菌を用いてグルタミン酸を製造する際には、発酵終了時のL-グルタミン酸の培地中への蓄積濃度を高めること、および使用原料(W)当りのグルタミン酸の生成量(対糖収率)を向上させることが工業的に重要である。上記目的を達成するために、生産菌の育種改良が種々検討されている.たとえば、グルタミン酸のアナログ(構造類似体)またはグルタミン酸生合成経路の各種中間体のアナログ等に耐性を示す菌株を作製することにより、各種酵素活性のフィードバック阻害や抑制の解除された菌株を育種する方法.またグルタミン酸生合成経路の途中より分岐して副生産物の合成に向かう経路の酵素活性の低下した菌株を育種する方法等が試みられている。」(第2頁左下欄第19行?右下欄第12行)

22.甲第35号証
(甲35-1)「基本培地(50ml)を、5mlシード培地と共に、500mlエルレンマイヤーフラスコに2度接種し、ロータリー振とうインキュベーター中、30℃で6日間培養した。」(第151頁右欄第5行?第7行)

(甲35-2)「振とうフラスコ中、撹拌数が50rpmから200rpmに増えると、L-リジン生産は急速に増加し、その後横ばいになった。糖の利用は50rpmから300rpmで増加したが、最大収率は200rpmで観察された(図2)。」(第151頁右欄下から第5行?最終行)

第6 乙号証の記載事項
乙第19号証には、以下の事項が記載されている(英語で記載されているため、日本語訳で摘記する。)。

1.乙第19号証
(乙19-1)「相対的に強固な主鎖角を有するプロリン残基(68)とプロリン残基が水素結合形成の際に供与するアミド基の水素原子を欠如していることが、プロリンをよく知られたCK-ヘリックス構造の破壊者としている(69)。その代りに、相対的に親水性のプロリンの残基は(70)、β-ターン構造にプロリンが頻繁に存在する(すべてトランス型のペプチド結合と共に)ことからも明らかなように、タンパク質鎖の折り畳みを促進する主たる構造上の役割を果たしている(総説として、参考文献71参照)。」(第919頁左欄第8行?第15行)

第7 当審の判断
1.無効理由3(甲第8号証を主引用例とする進歩性)について
(1)甲第8号証に記載された発明
上記記載事項(甲8-1)、(甲8-2)及び(甲8-5)によると、甲第8号証には、「大腸菌のMscSとの類似性が示唆される浸透圧調節チャネルを有するコリネバクテリウム・グルタミカム」の発明(以下、「甲8発明」という。)が記載されていると認められる。
なお、請求人は、審判請求書第61頁において、「甲第8号証には、以下の発明(「甲8発明」)が開示されている。 L-グルタミン酸の排出に関わる、E.coliのMscSとの類似性が示唆される浸透圧制御チャネルを有する、コリネバクテリウム・グルタミカム。」と主張し、上記記載事項(甲8-1)及び(甲8-3)を、甲第8号証に「L-グルタミン酸の排出に関わる、E.coliのMscSとの類似性が示唆される浸透圧制御チャネル」が開示されている根拠としているが、甲第8号証には、上記記載事項(甲8-3)の表1の結果に基づいて、「当該チャネルは、グリシンベタイン及びプロリンのような相溶性の溶質の排出を優先的に媒介する。同じような大きさの分子、例えば、グルタミン酸又はリジンの遊離は、制限され、」と記載され(上記記載事項(甲8-1))、また、上記記載事項(甲8-3)の表1の結果は、甲第8号証に記載の「E.coliのMscSとの類似性が示唆される浸透圧制御チャネル」が、L-グルタミン酸の排出に関与することを示すものではないから、上記記載事項(甲8-1)及び(甲8-3)をみても、コリネバクテリウム・グルタミカムの「E.coliのMscSとの類似性が示唆される浸透圧調節チャネル」が、L-グルタミン酸の排出に関わることが甲第8号証に記載されているとは認められないので、請求人の上記主張は採用できない。

(2)本件訂正発明1について
ア 本件訂正発明1と甲8発明との対比
本件明細書の段落【0006】には、「コリネ型細菌のyggB遺伝子は、エシェリヒア・コリのyggB遺伝子のホモログであり(非特許文献2,3)、メカノセンシティブチャンネル(mechanosensitive channel)の一種として解析されているが、(非特許文献4)」と記載されており、また、メカノセンシティブチャンネルが浸透圧調節チャネルとしての機能を有することは技術常識である。
よって、本件訂正発明1に記載のyggB遺伝子は、浸透圧調節チャネルの一種の遺伝子であり、また、コリネバクテリウム・グルタミカムなどのコリネ型細菌が、浸透圧調節チャネルを有していれば、その遺伝子を有することは明らかであるから、本件訂正発明1と甲8発明とを対比すると、両者は、浸透圧調節チャネル遺伝子を有するコリネ型細菌である点で一致し、以下の点で相違する。
(相違点)本件訂正発明1は、L-グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、変異型yggB遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してL-グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって、前記変異型yggB遺伝子は、(i)配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸配列のアミノ酸番号419-533の領域もしくは配列番号62のアミノ酸番号419-529の領域の欠失、(i’)配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸配列のアミノ酸番号419-533の領域もしくは配列番号62のアミノ酸番号419-529の領域へのインサーションシーケンス又はトランスポゾンの挿入、(i’’)配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸配列のアミノ酸番号419-533の領域もしくは配列番号62のアミノ酸番号419-529の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異、または(ii)配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列のアミノ酸番号1-23、86-108、及び110-132からなる群から選ばれる領域における1?5個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入の変異が導入された、コリネ型細菌であるのに対し、甲8発明は、そのような特定がされていない点。

イ 相違点についての検討
上記相違点について検討する。
上記記載事項(甲8-5)には、「C.グルタミカムのチャネルは、電気生理学的技術を用いることにより大腸菌において同定されたその他のタイプ、即ち、MscSと類似するかもしれない」との示唆があるものの、上記記載事項(甲8-1)?(甲8-5)は、甲第8号証に記載の浸透圧調節チャネルの遺伝子が、yggB遺伝子であることを示す記載とはいえず、また、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製し、その変異型yggB遺伝子をコリネ型細菌に導入することを開示も示唆もしていない。
甲第2号証には、コリネ型細菌において、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損させることが記載されている(上記記載事項(甲2-1)?(甲2-4))が、上記記載事項(甲2-1)?(甲2-4)は、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製し、その変異型yggB遺伝子をコリネ型細菌に導入することを開示も示唆もしていない。
甲第10号証には、コリネバクテリウム・グルタミカムに、大腸菌のyggB遺伝子及びMscL遺伝子のホモログが存在すること、yggB遺伝子ホモログのオープンリーディングフレームはCgl1270であること、yggB欠失変異体はベタインの排出速度を低下させたことが記載されている(上記記載事項(甲10-1)?(甲10-5))が、yggB遺伝子がL-グルタミン酸の排出に関与することは記載されておらず、上記記載事項(甲10-1)?(甲10-5)は、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製し、その変異型yggB遺伝子をコリネ型細菌に導入することを示唆する記載であるとはいえない。
甲第13号証には、大腸菌において、yggBの106番目のアラニンに相当する、ホモログタンパク質KefAにおける922番目の位置での変異は、圧力に対してより感受性であるチャネルを形成し、カリウムに対して超過敏の細胞を形成することが報告されており、チャネルのこの領域の機能的な重要性を強調することが記載されている((甲13-1)?(甲13-2))が、甲第13号証は、コリネバクテリウム・グルタミカムのyggB遺伝子に関する文献ではなく、また、L-グルタミン酸の排出に関する記載もないから、上記記載事項(甲13-1)?(甲13-3)は、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製し、その変異型yggB遺伝子をコリネ型細菌に導入することを示唆する記載であるとはいえない。
甲第14号証には、大腸菌のメカノセンシティブチャンネルには、MscM、MscS及びMscLがあること、YggBはMscSに改名すべきであること、大腸菌のyggBは、286個のアミノ酸より構成される3回膜貫通タンパク質であること、MscSにはゲイン・オブ・ファンクション(GOF)変異体があり、T93R、L109S及びA102Pのアミノ酸置換を有するGOF変異体を得ることが記載されている(上記記載事項(甲14-1)?(甲14-6))が、甲第14号証は、コリネバクテリウム・グルタミカムのyggB遺伝子に関する文献ではなく、また、L-グルタミン酸の排出に関する記載もないから、上記記載事項(甲14-1)?(甲14-6)は、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製し、その変異型yggB遺伝子をコリネ型細菌に導入することを示唆する記載であるとはいえない。
甲第15号証には、大腸菌のyggBの膜貫通ドメインTM3は、TM3A及びTM3Bで構成され、TM3A(96-113番目のアミノ酸)がチャネルのポアを形成すること、TM3Aの101番目のグリシン、102番目のアラニン、105番目のロイシン及び106番目のアラニンが、チャネルのポアの遮蔽に関与していることが記載されている(上記記載事項(甲15-1)?(甲15-4))が、甲第15号証は、コリネバクテリウム・グルタミカムのyggB遺伝子に関する文献ではなく、また、L-グルタミン酸の排出に関する記載もないから、上記記載事項(甲15-1)?(甲15-4)は、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製し、その変異型yggB遺伝子をコリネ型細菌に導入することを示唆する記載であるとはいえない。
よって、甲第2、10、13?15号証の記載は、コリネバクテリウム・グルタミカムのyggB遺伝子がL-グルタミン酸の排出に関与することを示す記載であるとはいえず、また、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製し、その変異型yggB遺伝子をコリネ型細菌に導入することを示唆する記載であるとはいえない。また、周知技術ないし技術常識を示す証拠として提出された甲第3?4、7、9、12、17?24号証、甲第25号証の1、甲第30、35号証にも、コリネバクテリウム・グルタミカムのyggB遺伝子がL-グルタミン酸の排出に関与することを示す記載はなく、また、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製し、その変異型yggB遺伝子をコリネ型細菌に導入することの動機付けとなるような記載はないから、甲第2、10、13?15号証の記載及び本願優先日前の周知技術に基づいても、甲8発明において、浸透圧調節チャネルの遺伝子として、yggB遺伝子を選択し、さらに、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製し、その変異型yggB遺伝子をコリネ型細菌に導入することは、当業者が容易に想到し得ることとはいえない。

ウ 本件訂正発明1の効果について
本件明細書の実施例2?13の記載から、本件訂正発明1は、L-グルタミン酸生産能を向上させたコリネ型細菌を提供することができるという、甲8発明に比べて格別顕著な効果を奏するといえる。

エ まとめ
したがって、本件訂正発明1は、甲第8号証、甲第2号証、甲第10号証、甲第13号証、甲第14号証及び甲第15号証に記載された発明、並びに周知技術に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。

(3)請求人の主張について
請求人は、平成29年10月2日付け弁駁書において、「グルタミン酸生産能を有することが周知であったコリネ型細菌について、L-グルタミン酸の生産性を高めるという周知の課題を解決するために、重要な問題として認識されていた菌体内のL-グルタミン酸の菌体外への排出に着目し(技術常識)、コリネ型細菌のL-グルタミン酸の排出能を増強することは、当業者が容易に試みる事項である。その際、L-グルタミン酸の排出能を有する浸透圧制御チャネルを標的として選択し、それによるL-グルタミン酸の排出効率を高めることは当然である。 L-グルタミン酸の排出効率を高める手段として、浸透圧制御チャネルかつ機械受容チャネルであるyggB(MscS)のTM3に変異を導入することが知られていた(甲14発明及び甲15発明)。TM3(およそ96-127番目のアミノ酸)は、yggBタンパク質のチャネルのポア形成に重要であり、TM3の変異により、チャネルがオープンになった状態が実現する。 そこで、L-グルタミン酸の排出効率を高めることを目的として、甲8発明のコリネバクテリウム・グルタミカムのyggB(Cgl1270に特定される(甲10号証)。)に対し、甲14発明又は甲15発明を適用してTM3のアミノ酸を変異させ、相違点1の構成を採用することは、当業者が容易に想到し得た事項である。」と主張している。
しかしながら、上記(2)イで述べたように、甲第14号証、甲第15号証は、yggB(MscS)がL-グルタミン酸の排出に関与するチャネルであることを示す文献ではないから、「L-グルタミン酸の排出効率を高める手段として、浸透圧制御チャネルかつ機械受容チャネルであるyggB(MscS)のTM3に変異を導入することが知られていた(甲14発明及び甲15発明)。」との請求人の上記主張は失当であり、また、上記(1)及び(2)イで述べたように、「甲8発明」は、「大腸菌のMscSとの類似性が示唆される浸透圧調節チャネルを有するコリネバクテリウム・グルタミカム」の発明であり、当該浸透圧調節チャネルがyggBであることを示す記載は甲第8号証にはないから、「甲8発明のコリネバクテリウム・グルタミカムのyggB」との請求人の上記主張は失当である。
また、上記(1)及び(2)イで述べたように、甲第8号証、甲第10号証には、コリネバクテリウム・グルタミカムのyggBが、L-グルタミン酸の排出に関与することが記載されているとはいえないから、甲8発明の「大腸菌のMscSとの類似性が示唆される浸透圧調節チャネル」に対して、甲第10号証の記載を参照して、甲第14号証、甲第15号証の記載事項を適用しても、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製し、その変異型yggB遺伝子をコリネ型細菌に導入することは、当業者が容易に想到し得ることとはいえないから、請求人の上記主張は採用できない。

(4)本件訂正発明6?7、9?11について
本件訂正発明6?7、9?10は、本件訂正発明1に更なる限定を加えた発明であり、また、本件訂正発明11は、本件訂正発明1のコリネ型細菌を使用する方法の発明であるから、上記(2)で述べたように、本件訂正発明1が、甲第8号証、甲第2号証、甲第10号証、甲第13号証、甲第14号証及び甲第15号証に記載された発明、並びに周知技術に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない以上、本件訂正発明6?7、9?11も、甲第8号証、甲第2号証、甲第10号証、甲第13号証、甲第14号証及び甲第15号証に記載された発明、並びに周知技術に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。

(5)本件訂正発明4について
本件訂正発明4は、訂正前の請求項1を引用する記載であったものを、請求項1の記載を引用しないものとし、独立請求項とした発明であり、実質的に本件訂正発明1の(ii)の「配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列のアミノ酸番号1-23、86-108、及び110-132からなる群から選ばれる領域における1?5個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入」の変異の下位概念に該当する「配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、100位のアラニンをスレオニンに、及び/または111位のアラニンをスレオニンもしくはバリンに置換する変異」を有する変異型yggB遺伝子が導入されたコリネ型細菌に係る発明であるから、上記(2)で述べたように、本件訂正発明1が、甲第8号証、甲第2号証、甲第10号証、甲第13号証、甲第14号証及び甲第15号証に記載された発明、並びに周知技術に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない以上、本件訂正発明4も、甲第8号証、甲第2号証、甲第10号証、甲第13号証、甲第14号証及び甲第15号証に記載された発明、並びに周知技術に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。

(6)本件訂正発明12について
ア 本件訂正発明12と甲8発明との対比
本件明細書の段落【0006】には、「コリネ型細菌のyggB遺伝子は、エシェリヒア・コリのyggB遺伝子のホモログであり(非特許文献2,3)、メカノセンシティブチャンネル(mechanosensitive channel)の一種として解析されているが、(非特許文献4)」と記載されており、また、メカノセンシティブチャンネルが浸透圧調節チャネルとしての機能を有することは技術常識である。
よって、本件訂正発明12に記載のyggB遺伝子は、浸透圧調節チャネルの一種の遺伝子であり、また、コリネバクテリウム・グルタミカムなどのコリネ型細菌が、浸透圧調節チャネルを有していれば、その遺伝子を有することは明らかであるから、本件訂正発明12と甲8発明とを対比すると、両者は、浸透圧調節チャネル遺伝子である点で一致し、以下の点で相違する。
(相違点)本件訂正発明12は、「下記(a)?(n)より選ばれる変異型yggB遺伝子:
(a) 配列番号8のアミノ酸配列をコードするDNA、
(b) 配列番号8のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(c) 配列番号20のアミノ酸配列をコードするDNA、
(d) 配列番号20のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(e) 配列番号22のアミノ酸配列をコードするDNA、
(f) 配列番号22のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(g) 配列番号24のアミノ酸配列をコードするDNA、
(h) 配列番号24のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(i) 配列番号64のアミノ酸配列をコードするDNA、
(j) 配列番号64のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(k) 配列番号70のアミノ酸配列をコードするDNA、
(l) 配列番号70のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(m) 配列番号74のアミノ酸配列をコードするDNA、
(n) 配列番号74のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。」であるのに対し、甲8発明は、そのような特定がされていない点。

イ 相違点についての検討
上記相違点について検討する。
上記記載事項(甲8-5)には、「C.グルタミカムのチャネルは、電気生理学的技術を用いることにより大腸菌において同定されたその他のタイプ、即ち、MscSと類似するかもしれない」との示唆があるものの、上記記載事項(甲8-1)?(甲8-5)は、甲第8号証に記載の浸透圧調節チャネルの遺伝子が、yggB遺伝子であることを示す記載とはいえず、また、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製することを開示も示唆もしていない。
甲第2号証には、コリネ型細菌において、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損させることが記載されている(上記記載事項(甲2-1)?(甲2-4))が、上記記載事項(甲2-1)?(甲2-4)は、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製することを開示も示唆もしていない。
甲第10号証には、コリネバクテリウム・グルタミカムに、大腸菌のyggB遺伝子及びMscL遺伝子のホモログが存在すること、yggB遺伝子ホモログのオープンリーディングフレームはCgl1270であること、yggB欠失変異体はベタインの排出速度を低下させたことが記載されている(上記記載事項(甲10-1)?(甲10-5))が、yggB遺伝子がL-グルタミン酸の排出に関与することは記載されておらず、上記記載事項(甲10-1)?(甲10-5)は、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製することを示唆する記載であるとはいえない。
甲第13号証には、大腸菌において、yggBの106番目のアラニンに相当する、ホモログタンパク質KefAにおける922番目の位置での変異は、圧力に対してより感受性であるチャネルを形成し、カリウムに対して超過敏の細胞を形成することが報告されており、チャネルのこの領域の機能的な重要性を強調することが記載されている((甲13-1)?(甲13-2))が、甲第13号証は、コリネバクテリウム・グルタミカムのyggB遺伝子に関する文献ではなく、また、L-グルタミン酸の排出に関する記載もないから、上記記載事項(甲13-1)?(甲13-3)は、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製することを示唆する記載とはいえない。
甲第14号証には、大腸菌のメカノセンシティブチャンネルには、MscM、MscS及びMscLがあること、YggBはMscSに改名すべきであること、大腸菌のyggBは、286個のアミノ酸より構成される3回膜貫通タンパク質であること、MscSにはゲイン・オブ・ファンクション(GOF)変異体があり、T93R、L109S及びA102Pのアミノ酸置換を有するGOF変異体を得ることが記載されている(上記記載事項(甲14-1)?(甲14-6))が、甲第14号証は、コリネバクテリウム・グルタミカムのyggB遺伝子に関する文献ではなく、また、L-グルタミン酸の排出に関する記載もないから、上記記載事項(甲14-1)?(甲14-6)は、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製することを示唆する記載であるとはいえない。
甲第15号証には、大腸菌のyggBの膜貫通ドメインTM3は、TM3A及びTM3Bで構成され、TM3A(96-113番目のアミノ酸)がチャネルのポアを形成すること、TM3Aの101番目のグリシン、102番目のアラニン、105番目のロイシン及び106番目のアラニンが、チャネルのポアの遮蔽に関与していることが記載されている(上記記載事項(甲15-1)?(甲15-4))が、甲第15号証は、コリネバクテリウム・グルタミカムのyggB遺伝子に関する文献ではなく、また、L-グルタミン酸の排出に関する記載もないから、上記記載事項(甲15-1)?(甲15-4)は、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製することを示唆する記載であるとはいえない。
よって、甲第2、10、13?15号証の記載は、コリネバクテリウム・グルタミカムのyggB遺伝子がL-グルタミン酸の排出に関与することを示す記載であるとはいえず、また、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製することを示唆する記載であるとはいえない。また、周知技術ないし技術常識を示す証拠として提出された甲第3?4、7、9、12、17?24号証、甲第25号証の1、甲第30、35号証にも、コリネバクテリウム・グルタミカムのyggB遺伝子がL-グルタミン酸の排出に関与することを示す記載はなく、また、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製することの動機付けとなるような記載はないから、甲第2、10、13?15号証の記載及び本願優先日前の周知技術に基づいても、甲8発明において、浸透圧調節チャネルの遺伝子として、yggB遺伝子を選択し、さらに、L-グルタミン酸生産能を向上させるために、変異型yggB遺伝子を作製することは、当業者が容易に想到し得ることとはいえない。

ウ 本件訂正発明12の効果について
本件明細書の実施例2?13の記載から、本件訂正発明12は、L-グルタミン酸生産能を向上させたコリネ型細菌を提供することができるという、甲8発明に比べて格別顕著な効果を奏するといえる。

エ まとめ
したがって、本件訂正発明12は、甲第8号証、甲第2号証、甲第10号証、甲第13号証、甲第14号証及び甲第15号証に記載された発明、並びに周知技術に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。

2.無効理由4(実施可能要件)及び無効理由5(サポート要件)について
(1)本件発明の詳細な説明の記載内容
本件発明の詳細な説明には、以下の内容が記載されている。

ア.「【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、コリネ型細菌を用いたL-グルタミン酸の製造において、L-グルタミン酸生産能力を向上させる新規な技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本研究者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、yggB遺伝子がコリネ型細菌のL-グルタミン生産に関与していることを明らかにし、yggB遺伝子を用いてコリネ型細菌を改変することにより、L-グルタミン酸の生産能が大幅に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。」(段落【0007】?【0008】)

イ.「【0069】
<III> 本発明の変異型yggB遺伝子
以下、変異型yggB遺伝子の具体例を挙げる。ただし、変異型yggB遺伝子は、コリネ型細菌においてビオチンが過剰量存在する条件で、L-グルタミン酸生産能を向上させうる変異であれば特に制限されない。
【0070】
(III-1)C末端側変異
この変異は、配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸番号419-533の配列、または配列番号62のアミノ酸番号419-529の配列をコードする領域の塩基配列の一部に導入された変異である。例えば、この領域は、配列番号5の塩基配列においては、塩基番号2692-3035番目に相当する。上記領域の塩基配列中の少なくとも一部に変異が導入されていればいずれでもよいが、インサーションシーケンス(以下ISという)や、トランスポゾンが挿入されたものが好ましい。変異は、アミノ酸置換を伴うもの(ミスセンス変異)や、上記ISの挿入によってフレームシフト変異が導入されたもの、ナンセンス変異が導入されたものの何れでもよい。
【0071】
(III-1-1)転移因子の挿入による変異(2A-1型変異)
C末端側変異の一例として、配列番号5の2691番目のGの次にISが挿入された変異が挙げられる。この変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号7に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号8に示す。配列番号8においては、配列番号6の419位のバリンから下流の領域が短いISに由来する配列に置換されている。なお、配列番号7にて挿入されたISは、IS1207(Genbank accession No. X96962) 、IS719: (Genbank accession No E12759)と相同性の高い配列である。
上記変異型yggB遺伝子を2A-1型変異と呼ぶ。2A-1型変異には、配列番号6、62、68、84および85のC末端側の該領域を欠失または置換する変異が含まれる。
また、上記領域に他のISが挿入されたもの、例えば上述したようなtransposaseをコードするISが挿入されたものも、本発明の範囲に含まれる。transposaseが導入される位置は上記領域のいずれの位置でもよいが、それぞれのtransposaseが認識しやすい箇所やISが挿入しやすいホットスポットの位置が好ましい。
【0072】
(III-1-2)プロリン残基を他のアミノ酸に置換する変異(66型変異、22型変異)
またC末端側変異の一例として、配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸番号419-533の配列、または配列番号62のアミノ酸番号419-529の領域内に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異が挙げられる。置換してもよいプロリンは、配列番号6の以下の位置に存在する。
424番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の424番目)
437番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の437番目)
453番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の453番目)
457番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の457番目)
462番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の462番目)
469番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の469番目)
484番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の484番目)
489番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の489番目)
497番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の497番目)
515番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の515番目)
529番目のプロリン残基(配列番号68、84、85の529番目、配列番号62番目の525番目)
533番目のプロリン残基(配列番号68、84、85の533番目、配列番号62番目の529番目)
yggB遺伝子のC末端側のプロリン残基は、YggBタンパク質の立体構造維持の為に重要な役割を果たしていると考えられる。(Protein Eng. 2002 Jan;15(1):29-33、J Biol Chem.1991 Dec 25;266(36):24287-94.)中でも424番目と437番目のプロリンが他のアミノ酸に置換することが望ましい。ここで他のアミノ酸とは、プロリン以外のアミノ酸で天然型アミノ酸であればいずれのアミノ酸でもよく、Lys,Glu,Thr,Val,Leu,Ile,Ser,Asp,Asn,Gln,Arg,Cys,Met,Phe,Trp,Tyr,Gly,Ala,Hisから選択される残基に置換すればよい。特に、424番目のプロリンは、疎水性アミノ酸であるAla、Gly、Val、Leu、Ileに置換されることが望ましく、中でも分岐鎖アミノ酸であるLeu、Val、Ileが望ましい。(66型変異)424番目のプロリンをロイシンに置換する変異として、例えば、配列番号67の1673位の“C”を“T”に置換する変異が挙げられる。この変異型yggB遺伝子を配列番号69に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号70に示す。
また、437番目のプロリンは、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸(Thr,Ser,Tyr)に置換することが望ましく、中でもSerへの置換が望ましい。(22型変異)437番目のプロリンをセリンに置換する変異としては、例えば配列番号5の2745位のCをTに置換する変異が挙げられる。また、本変異は、3060位のCをTに置換する変異を伴っていてもよい。この変異型yggB遺伝子を配列番号73に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号74に示す。
【0073】
(III-2)膜貫通領域の変異
yggB遺伝子がコードするYggBタンパク質は、5個の膜貫通領域を有していると推測される。配列番号6、62、68、84、85の野生型のYggBタンパク質のアミノ酸配列において、膜貫通領域はそれぞれ、アミノ酸番号1?23(第1膜貫通領域)、25?47(第2膜貫通領域)、62?84(第3膜貫通領域)、86?108(第4膜貫通領域)、110?132(第5膜貫通領域)の領域に相当する。これらをコードするDNAは配列番号5の1437-1505、1509-1577、1620-1688、1692-1760、1764-1832番目の塩基に該当する。本発明の変異は、この膜貫通領域をコードするDNA内に変異を有していることが望ましく、変異導入は1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入又は逆位を含む変異で、フレームシフト変異、ナンセンス変異を伴わないものが望ましい。従って、ここでアミノ酸配列の置換の場合は、アミノ酸置換を伴うミスセンス変異が好ましく、上記数個の置換、欠失、付加、挿入又は逆位とは、2?20個、好ましくは2?10個、より好ましくは2?5個、さらに好ましくは2?3個を意味する。またアミノ酸の挿入、欠失変異は、1?数塩基のポイントミューテーションの導入や、フレームシフト変異を伴わない塩基配列導入、例えば、3,6,9,12,15,18、または21塩基の挿入または欠失、好ましくは、3,6、または9塩基の欠失または挿入、より好ましくは3塩基の塩基配列の欠失または挿入が望ましい。
【0074】
例えば、以下のような変異が例として挙げられる。
(III-2-1)第1膜貫通領域の変異(A1型変異)
この変異は、配列番号6、62、68、84、85に示されるアミノ酸配列において、14番目のロイシン残基、15番目のトリプトファン残基間に1又は数アミノ酸挿入された変異である。具体例としては、14番目のロイシン残基、15番目のトリプトファン残基間に、3アミノ酸導入されたもの、例えばCys-Ser-Leuが挿入されたものが挙げられ、この変異の例として、配列番号5の1480番目のGの次にTTCATTGTGが挿入された変異が挙げられる。この変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号19に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号20に示す。
【0075】
(III-2-2)第4膜貫通領域の変異(19型変異)
この変異は、配列番号6、62、68、84、85に示されるアミノ酸配列において、100番目のアラニン残基が、他のアミノ酸残基へ置換した変異である。他のアミノ酸とは、アラニン以外のアミノ酸残基であればいずれでもよく、他のアミノ酸とはアルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、バリン、スレオニンを意味するが、中でも側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸(スレオニン、セリン、チロシン)に置換されていることが望ましく、特にスレオニン残基に置換されていることが望ましい。一例として配列番号5の1734番目のGがAに置換された変異が挙げられる。この変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号21に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号22に示す。
【0076】
(III-2-3)第5膜貫通領域の変異(L30型変異、8型変異)
この変異は、配列番号6、62、68、84、85に示されるアミノ酸配列において、111番目のアラニン残基が、他のアミノ酸残基へ置換した変異である。他のアミノ酸とは、アラニン以外のアミノ酸残基であれば、いずれでもよく、他のアミノ酸とはアルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、バリン、スレオニンを意味するが、中でも分岐鎖アミノ酸(バリン、イソロイシン、ロイシン)、特にバリン残基や、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸(スレオニン、セリン、チロシン)、特にスレオニン残基に置換されていることが望ましい。この変異の例として、配列番号5の1768番目のCがTに置換された変異(L30型変異)や、配列番号61の837番目のGがAに置換された変異(8型変異)が挙げられる。L30型変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号23に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号24に示す。8型変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号63に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号64に示す。
【0077】
上記の「変異型yggB遺伝子」は、ビオチンが過剰量存在する条件におけるL-グルタミン酸生産能を向上させる機能を有する限り、上述の変異を含む機能的に均等な遺伝子、例えば、配列番号7の塩基番号1437?2705の塩基配列を含むDNA、配列番号19の塩基番号1437?3044の塩基配列を含むDNA、配列番号21の塩基番号1437?3035の塩基配列を含むDNA、配列番号23の塩基番号1437-3035の塩基配列を含むDNA、配列番号63の塩基番号507-2093の塩基配列を含むDNA、配列番号69の塩基番号403-2001の塩基配列を含むDNA、配列番号73の塩基番号548-2146の塩基配列を含むDNAのような変異型遺伝子と実質的に相同な遺伝子で、これらと相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該塩基配列の一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここでストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件のことをいう。例えば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件が挙げられ、具体的には、60℃、0.1×SSC、0.1%SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度、温度で、1回より好ましくは2?3回洗浄する条件が挙げられる。
【0078】
変異型yggB遺伝子がコードするタンパク質としては、同タンパク質の活性がビオチンが過剰量存在する条件においてL-グルタミン酸生産能を向上させる機能を有する限り、機能的に均等なタンパク質例えば、配列番号8、20、22、24、64,70,74から選択されるアミノ酸配列において、上記変異点のアミノ酸以外にさらに、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで、数個とは、例えば、2?20個、好ましくは2?10個、より好ましくは2?5個を意味する。上記置換は保存的置換(中性変異)が好ましく、保存的置換としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。また、上述したように、配列番号85のXaaのアミノ酸が置換されてもよい。さらに、本発明のyggB遺伝子は、配列番号8、20、22、24、64,70,74のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌で変異型yggBがコードするタンパク質と同等の活性を有するタンパク質をコードするホモログも含む。
【0079】
特に、以下のアミノ酸は配列番号8、20、22、24、64,70,74のアミノ酸配列において置換されていてもよい。
48位のGlu(好ましくはArgによる置換)
275位のAsp(好ましくはSerによる置換)
298位のGlu(好ましくはAlaによる置換)
343位のAla(好ましくはValによる置換)
396位のPhe(好ましくはIleによる置換)
438位のSer(好ましくはGlyによる置換)
445位のVal(好ましくはAlaによる置換)
454位のAla(好ましくはValによる置換)
457位のPro(好ましくはSerによる置換)
474位のSer(好ましくはAspによる置換)
517位のVal(好ましくは欠失)
518位のGlu(好ましくは欠失)
519位のAla(好ましくは欠失)
520位のPro(好ましくは欠失)」(段落【0069】?【0079】)

ウ.「【0081】
本発明のコリネ型細菌は、変異型yggB遺伝子を導入することにより、L-グルタミン酸アナログに対する耐性が向上したものであってもよい。本発明でL-グルタミン酸アナログとは、L-グルタミン酸-γ-メチルエステル、α-メチルグルタミン酸、β-ヒドロキシグルタミン酸、メチオニンスルホキシミン、グルタミン酸-γ-モノヒドロキサメ-ト、2-アミノ-4-ホスホノ酪酸、L-グルタミン酸-γ-モノエチルエステル、L-グルタミン酸ジメチルエステル、L-グルタミン酸-ジ-t-ブチルエステル、モノフロログルタミン酸、L-グルタミン酸ジエチルエステル、D-グルタミン酸、4-フルオログルタミン酸が挙げられる。L-グルタミン酸アナログに対する耐性の向上とは、最少培地に4-フルオログルタミン酸を添加して一昼夜培養した際に、親株の生菌数(コロニー形成能を有する菌数)を1/100まで抑制できるような濃度においても1/10以上の増殖を示すことをいう。具体的には、1.25mM、好ましくは2.5mM、より好ましくは、5mM以上の4-フルオログルタミン酸に耐性を有することを意味する。
」(段落【0081】)

エ.「【実施例2】
【0095】
<C.glutamicum ATCC13869由来odhA変異株の構築>
コリネ型細菌のα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードしているodhA遺伝子の配列は既に明らかにされている(Microbiology 142,3347-3354,(1996)、GenBank accession No.D84102)。公開されているodhA遺伝子の配列を基に、配列番号1、2に記載のプライマーを設計しATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、odhA遺伝子の内部配列のみを増幅した。増幅したPCR断片をBamHIで完全分解し、実施例1で構築したpBS4SのBamHI部位に挿入したプラスミドpBS4SΔsucAintを構築した(構築図は図3に記載)。
【0096】
電気パルス法(特開平2-207791)にてC.glutamicum ATCC13869へpBS4SΔsucAintを導入し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex寒天培地(グルコース 5g/l、ポリペプトン 10g/l、酵母エキス 10g/l、KH_(2)PO_(4) 1g/l、MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l、FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l、MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l、尿素 3g/l、大豆蛋白加水分解液1.2g/l、寒天 20g/l、NaOHを用いてpH7.5に調整:オートクレーブ120℃20分)上に塗布した。31.5℃にて培養後、生育してきた株を、相同組換えによって染色体上にpBS4SΔsucAintが組み込まれた1回組換え株であることをPCRにて確認した。なお1回組換え株であることの確認は、候補株の染色体を鋳型にし、pBS4S上の特異的配列(配列番号3)と染色体上の配列(配列番号4)をプライマーにしたPCRを行うことによって、容易に確認することが出来る(非組み換え株の染色体上にはpBS4Sの配列が存在していないため、PCRによって増幅される断片が出現しないことから判別可能となる)。
【0097】
こうして取得した1回組換え株を2A-1株と名付けた。野生株ATCC13869および2A-1株を20mlのフラスコ培地(グルコース30g/l, 硫酸アンモニウム 15g/l, KH_(2)PO_(4) 1g/l, MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l, FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l, MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin300μg/l, 大豆加水分解物(T-N)0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費したのち、培地中のL-グルタミン酸濃度を測定した。結果を表1に示す(OD620は101倍希釈の濁度で菌体量の指標であり、Glu(g/L)はL-グルタミン酸の蓄積量を示す)。親株のATCC13869ではL-グルタミン酸を全く生成しない条件においても2A-1株ではL-グルタミン酸生産能を有することが確認された。
【0098】
【表1】

」(段落【0095】?【0098】)

オ.「【実施例3】
【0099】
<2A-1由来odhA復帰株の構築>
取得した2A-1株は、染色体上のodhA遺伝子がpBS4SΔT¥sucAintによって破壊されている。この株から染色体上のプラスミドを脱落させればodhAは野生型に復帰する。一方、odhAが欠損した株では、糖を含まない培地での生育が著しく遅いが、odhAが野生型に復帰すれば糖を含まないCM2B(ポリペプトン 10g/l、酵母エキス 10g/l、NaCl 5g/l、Biotin 10μg/L、寒天 20g/l、KOHを用いてpH7.0に調整)のような培地でも良好に生育すると推測される。そこで、2A-1株をCM2Bプレートに塗布し、生育改善株を誘導した。こうして出現した生育改善株2A-1R株をCM2Bプレートで純化し、そのカナマイシン感受性を調べたところ、すべてカナマイシン感受性であり、スクロース耐性であることが明らかとなった。
【0100】
pBS4SΔsucAintにはカナマイシン耐性遺伝子とレバンシュークラーゼをコードするsacB遺伝子が含まれているため、pBS4SΔsucAintを有する株ではカナマイシン耐性とスクロース感受性を示し、脱落した株ではカナマイシン感受性を示し、またスクロース耐性を示すこととなる。これらの結果から2A-1R株ではodhAが野生型に復帰していることが示唆された。さらにodhA遺伝子の配列を確認した結果、odhA遺伝子には変異がないことが確認されたことから、2A-1R株ではodhAは野生型に復帰していると結論した。2A-1R株のグルタミン酸生産能を実施例2と同様の方法で確認した。結果を表2に示す。(OD620は101倍希釈の菌体量、Glu(g/L)はL-グルタミン酸の蓄積量を示す)2A-1R株のグルタミン酸蓄積は2A-1株には劣るものの野生株ATCC13869よりも遥かに高いことが示された(表2)。また、糖を完全に消費した後も振とうを続けたところ、2A-1Rではグルタミン酸の分解が認められ、odhAが野生型に復帰していることが裏付けられた(図4)。
【0101】
【表2】

【実施例4】
【0102】
<2A-1R株のグルタミン酸生成に関与する遺伝子の単離>
2A-1R株は、CM2Bプレート培地上においては、野生株ATCC13869とほぼ変わらない速度でコロニーを形成できる。しかし、最少培地(グルコース20g/l,硫酸アンモニウム 2.64g/L, KH_(2)PO_(4) 0.5g/L, K_(2)HPO_(4) 0.5g/L, MgSO_(4)・7H_(2)O 0.25g/L, FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/L, MnSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/L,CaCl_(2) 0.01g/L, CuSO_(4) 0.02mg/L, MOPS 40g/L, プロトカテク酸 30mg/L, VB1・HCl200μg/L, Biotin 300μg/L, 寒天 20g/L, NaOHを用いてpH6.7に調整)プレート上では野生株ATCC13869に比し著しくコロニー形成速度が低下していることが明らかとなった。そこで、最少培地で2A-1R株の生育を回復できる遺伝子の探索をおこなった。
【0103】
ATCC13869株の染色体DNAをSau3AIで部分分解し、シャトルベクターpVK9をBamHIで処理したものとライゲーションし、ライゲーション反応液をエタノール沈殿した後、E.coli DH5α(タカラバイオ)のエレクトロコンピテントセルを電気パルス法で形質転換した。pVK9は、pHSG299(タカラバイオ)のAvaII部位を平滑末端化し、pHK4(特開平05-007491)に含まれるコリネ型細菌内で自律複製可能な領域をBamHIおよびKpnIで切り出し平滑末端化した断片を挿入したシャトルベクターである。形質転換後の菌体はカナマイシン25μg/mlを含むLBプレート培地(ポリペプトン 10g/l、酵母エキス 5g/l、NaCl 5g/l、寒天 20g/l、NaOHを用いてpH7.0に調整)に塗布し、37℃で一晩培養した。翌日出現したコロニーを全てエーゼでかきとり、プラスミドを抽出しATCC13869のライブラリーとした。このライブラリーを実施例3で得られた2A-1R株に電気パルス法にて形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含む最少培地プレートに塗布し、コロニー形成速度が向上した株をスクリーニングした。コロニー形成速度が向上した株よりプラスミドを抽出した結果、配列番号5に記す断片がpVK9のBamHI部位に挿入されていたことが明らかとなった。このプラスミドをpL5kと命名した。
【0104】
pL5kの挿入配列と、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のゲノム配列(Acc.No.NC_003450)を比較した結果、pL5kには完全長のORFとして、配列番号6に示すアミノ酸配列をもつORFのみが含まれていることが明らかとなった。ORFが膜タンパク質か否かは、インターネット上で利用可能なプログラム「SOSUI」によって予測可能である(2004/10/07 現在http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0E.htmlにリンクされている)。「SOSUI」でこのORFを解析した結果、5回の膜貫通領域が存在していることが示唆された。配列番号6のアミノ酸配列において、膜貫通領域はそれぞれ、アミノ酸番号1?23、25?47、62?84、86?108、110?132の領域に相当する。これらをコードするDNA配列は、配列番号5の1437-1505、1509-1577、1620-1688、1692-1760、1764-1832番目の塩基配列に、膜貫通領域のアミノ酸配列は配列番号25-29、表3に示した
【0105】
【表3】

【0106】
さらに公知の文献を調べた結果、このORFはYggB(NCgl 1221)として解析されているORFであることが明らかとなった(FEMS Microbiology letters 218(2003)305-309)。
【実施例5】
【0107】
<2A-1R株のYggB遺伝子の変異点同定>
2A-1R株の最少培地における生育をpL5Kが相補したことから、2A-1R株のyggB遺伝子には何らかの変異がある可能性が示唆された。そこで、2A-1R株のyggB遺伝子の塩基配列を決定した。その結果2A-1R株ではYggB遺伝子のC末端側の領域にISが挿入されていることが明らかとなった(図5)。2A-1R株の変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号7に、アミノ酸配列を配列番号8に記した。このことから、2A-1R株のグルタミン酸生産能は、yggB遺伝子の変異によって維持されていた可能性が示唆された。なお、この変異は2A-1R株のみならず2A-1株にも存在していた。odhA遺伝子に変異を導入した際に、安定してグルタミン酸を細胞外に放出するためのサプレッサー変異として起こった変異であると推測される。ここで、ISが挿入されたこの変異を、2A-1型変異とした。」(段落【0099】?【0107】)

カ.「【実施例6】
【0108】
<2A-1型yggB変異株構築とL-グルタミン酸生産能評価>
(6-1)2A-1型変異の野生株への導入と評価(1回組換え株)
2A-1株の染色体DNAを鋳型として、配列番号9と配列番号10に示す合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、2A-1型変異を有するyggB遺伝子断片を増幅した。増幅産物はSacIで処理し、実施例1のpBS3のSacI部位に挿入した。2A-1型変異を有するyggB断片がクローニングされたプラスミドをpBS3yggB2Aと名付けた。電気パルス法にてC.glutamicum ATCC13869にpBS3yggB2Aを導入し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex寒天培地上に塗布した。31.5℃にて培養後生育してきた株を、相同組換えによって染色体上にpBS3yggB2Aが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。得られた一回組換え株を13869-2Aとした。この株では、野生型のyggB遺伝子と変異型のyggB遺伝子の両方が発現していることとなる。
【0109】
取得したyggB変異導入株13869-2Aのグルタミン酸生産能を、実施例2記載の方法にて確認した。その結果を表4に示す(OD620は101倍希釈の菌体量、Glu(g/L)はL-グルタミン酸の蓄積量を示す)。13869-2A株では、ATCC13869株がL-グルタミン酸を生成しない条件でも、明確なグルタミン酸生産能が確認できた。このことから、YggB遺伝子の変異により、グルタミン酸生産が誘導できることが示された。
【0110】
【表4】

【0111】
(6-2)2A-1型変異の野生株への導入と評価(2回組換え株)
変異型遺伝子のみを有する株を構築する為、13869-2A株をCM-Dex液体培地で一夜培養した懸濁液をS10寒天培地(スクロース 100g/l、ポリペプトン 10g/l、酵母エキス 10g/l、KH_(2)PO_(4) 1g/l、MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l、FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l、MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l、尿素 3g/l、大豆蛋白加水分解液1.2g/l、寒天 20g/l、NaOHを用いてpH7.5に調整:オートクレーブ120℃20分)上に塗布し31.5℃で培養した。出現したコロニーのうち、カナマイシン感受性を示す株をs2B寒天培地上で純化した。これらの株より染色体DNAを調整し、配列番号9と配列番号10に示す合成DNAをプライマーとしてPCRを行い変異を確認し、yggB遺伝子にIS様配列が挿入されていた株を13869-2A-7とした。
【0112】
取得した13869-2A-7株のグルタミン酸生産能を、実施例2記載の方法にて確認した。その結果を表5に示す。(OD620は101倍希釈の菌体量、Glu(g/L)はL-グルタミン酸の蓄積量を示す)。13869-2A-7株では、2A-1R株と同等以上のグルタミン酸生産能を示したことから、ビオチン過剰量存在下でのL-グルタミン酸生産は、yggB遺伝子の変異によって引き起こされることが確認できた。
【0113】
【表5】

」(段落【0108】?【0113】)

キ.「【実施例7】
【0114】
<A1型YggB変異株の構築と評価>
上述のL-グルタミン酸生産性のodhA変異株を解析した結果、上述の2A-1変異の他にyggB遺伝子上に5種類の変異を見出した。以下、それぞれA1型変異、19型変異、L30型変異、8型変異、66型変異とし、前者3つについてはATCC13869の染色体に変異を導入して効果を確認した。8型変異についてはATCC14067の染色体に変異を導入して効果を確認した。66型変異に関しては、C.melassecola ATCC17965の染色体に変異を導入して効果を確認した。
【0115】
A1型変異は、配列番号5の1480番目のGの次にTTCATTGTGが挿入された変異であり、配列番号6のアミノ酸配列の14番目のロイシン残基、15番目のトリプトファン残基間にシステイン、セリン、ロイシン残基が挿入された変異である。この変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号19に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号20に示す。
【0116】
A1型変異遺伝子の取得は次のようにすれば行うことが出来る。配列番号30に示す合成DNAと配列番号31に示す合成DNAをプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製する。同様に配列番号32と配列番号33の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号9と配列番号34の合成DNAをプライマーとしてPCRを行えばA1型YggB遺伝子の部分断片を取得できる。得られたYggB断片はSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドが構築可能である。このようにして得られたpBS4 YggBA1を実施例6記載の方法と同様にATCC13869株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、A1型に置換されていた株を選択すれば、A1型変異を有する株を構築することができる。このような変異を持つA1型変異株をATCC13869-A1株とした。
【0117】
ATCC13869-A1株と親株のATCC13869株を実施例2と同様の方法で培養を行った。培養終了後、培養液中に含まれるL-グルタミン酸の量を公知の方法で測定した。
A1変異を染色体上に導入した、ATCC13869-A1株は親株のATCC13869株と比べてL-グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
【0118】
【表6】

」(段落【0114】?【0118】)

ク.「【実施例8】
【0119】
<19型YggB変異株の構築と評価>
19型変異は、配列番号5の1734番目のGがAに置換された変異であり、配列番号6のアミノ酸配列の100番目のアラニンがスレオニンに置換された変異である。この変異が導入された変異型YggB遺伝子の塩基配列を配列番号21に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号22に示す。実施例7と同様の方法にて、19型変異が導入されたyggB変異株を構築した。具体的には、配列番号30に示す合成DNAと配列番号35に示す合成DNAをプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製する。同様に配列番号33と配列番号36の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号9と配列番号34の合成DNAをプライマーとしてPCRを行えば19型YggB遺伝子の部分断片を取得できる。得られたYggB断片はSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドが構築可能である。このようにして得られたpBS4 YggB19を実施例6記載の方法と同様にATCC13869株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、19型に置換されていた株を選択すれば、19型変異を有する株を構築することができる。このような変異を持つ19型変異株をATCC13869-19株とした。
【0120】
ATCC13869-19株と親株のATCC13869株を実施例2と同様の方法で培養を行った。培養終了後、培養液中に含まれるL-グルタミン酸の量を公知の方法で測定した。19変異を染色体上に導入した、ATCC13869-19株は親株のATCC13869株と比べてL-グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
【0121】
【表7】

」(段落【0119】?【0121】)


ケ.「【実施例9】
【0122】
<L30型YggB変異株の構築>
L30型変異は、配列番号5の1768番目のCがTに置換された変異であり、配列番号6の111番目のアラニンがバリンに置換された変異である。この変異が導入された変異型YggB遺伝子の塩基配列を配列番号23に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号24に示す。
実施例7と同様の方法にて、L30型変異が導入されたyggB変異株を構築した。具体的には、配列番号30に示す合成DNAと配列番号37に示す合成DNAをプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製する。同様に配列番号34と配列番号38の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号9と配列番号34の合成DNAをプライマーとしてPCRを行ないL30型YggB遺伝子の部分断片を取得する。得られた変異型YggB断片はSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドを構築した。このようにして得られたpBS4 YggB-Lを実施例6記載の方法と同様にATCC13869株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、L30型に置換されていた株を選択し、L30型変異を有する株を構築した。このような変異を持つL30型変異株をATCC13869-L株とした。
【0123】
ATCC13869株と、ATCC13869-L株を実施例2と同様の方法で培養を行い、培養終了後、培養液中に含まれるL-グルタミン酸の量を公知の方法で測定した。結果を表8に示す。(OD620は101倍希釈の菌体量、Glu(g/L)はL-グルタミン酸の蓄積量を示す)。L-30変異を導入したATCC13869-L30株は親株のATCC13869株と比べてL-グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
【0124】
【表8】

」(段落【0122】?【0124】)


コ.「【実施例10】
【0125】
<変異型yggB遺伝子導入株のL-グルタミン酸生成条件における培養評価>
コリネ型細菌はTween40等の脂肪酸系界面活性剤の添加や、ビオチン制限によりグルタミン酸生成を誘導できる。そこで、ATCC13869株とATCC13869-19株について、Tween40添加条件およびビオチン制限条件での培養も行った。シード培養は、20mlのフラスコ培地(グルコース80g/l, 硫酸アンモニウム 30g/l, KH_(2)PO_(4) 1g/l, MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l, FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l, MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物(T-N)0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費した培養液を種培養液とした。Tween40添加培養においては、種培養液2mlを20mlのフラスコ培地(グルコース80g/l, 硫酸アンモニウム 30g/l, KH_(2)PO_(4) 1g/l, MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l, FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l, MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物(T-N)0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。培養開始後、OD620(x101)=0.2に到達した時点で、最終濃度5g/LとなるようにTween40を添加し培養を継続した。ビオチン制限培養においては、種培養液1mlを20mlのフラスコ培地(グルコース80g/l, 硫酸アンモニウム 30g/l, KH_(2)PO_(4) 1g/l, MgSO_(4)・7H_(2)O0.4g/l, FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l, MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l, VB1 200μg/l, 大豆加水分解物(T-N)0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。この条件ではビオチンの終濃度が約2.9μg/Lとなる。
Tween40添加培養およびビオチン制限培養ともに、培養開始後40時間後の培地中のL-グルタミン酸濃度を測定した。結果を表9に示す(OD620は101倍希釈の菌体量、Glu(g/L)はL-グルタミン酸の蓄積量を示す)。ATCC13869-19株では、L-グルタミン酸生産条件でもL-グルタミン酸の蓄積の増大が認められた。
【0126】
【表9】

【0127】
ATCC13869株、ATCC13869-L30、ATCC13869-A1株、ATCC13869-19株、プラスミドによるyggB増幅株についても、Tween40添加培養を行なった。CM-Dexプレートに一夜培養した菌体を1/6プレート分かきとり、20mlのフラスコ培地(グルコース80g/l, 硫酸アンモニウム30g/l, KH_(2)PO_(4) 1g/l, MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l, FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l, MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物(T-N)0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。培養開始5時間後にTween40を終濃度1g/Lとなるように添加し、培養開始から24時間後の菌体量とL-グルタミン酸の収量を分析した。その結果、表10に示すように、ATCC13869-19, ATCC13869-L30, ATCC13869-A1株、野生型のyggB遺伝子増幅株(ATCC13869/pL5k-1)ともにL-グルタミン酸生産条件でのL-グルタミン酸の収量が向上していることが示された。
【0128】
【表10】

」(段落【0122】?【0128】)

サ.「【実施例11】
【0129】
<8型YggB変異株の構築>
8型変異は、配列番号61の837位のGがAに置換された変異であり、配列番号62の111位のアラニンがスレオニンに置換されている。この変異が導入された変異型YggB遺伝子の塩基配列を配列番号63に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号64に示す。
実施例7と同様の方法にて、8型変異が導入されたyggB変異株を構築する。具体的には、配列番号30に示す合成DNAと配列番号65に示す合成DNAをプライマーとして、Brevibacterium flavumATCC14067株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製する。同様に配列番号34と配列番号66の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号9と配列番号34の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、8型YggB遺伝子の部分断片を取得する。得られた変異型YggB断片はSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドを構築する。このようにして得られたpBS4 YggB8を実施例6記載の方法と同様にATCC14067株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、8型に置換されていた株を選択し、8型変異を有する株を構築する。このような変異を持つ8型変異株をATCC14067yggB8株とする。」(段落【0129】)

シ.「【実施例12】
【0130】
<66型YggB変異株の構築>
66型変異は、配列番号67の1673番目のCがTに置換された変異であり、配列番号68の424番目のプロリンがロイシンに置換されている。この変異が導入された変異型YggB遺伝子の塩基配列を配列番号69に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号70に示す。
実施例7と同様の方法にて、66型変異が導入されたyggB変異株を構築する。具体的には、配列番号30に示す合成DNAと配列番号71に示す合成DNAをプライマーとして、C.melassecolaATCC17965株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製した。同様に配列番号34と配列番号72の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号9と配列番号10の合成DNAをプライマーとしてPCRを行えば66型yggB遺伝子の部分断片を取得できる。得られた変異型YggB断片をSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドを構築する。このようにして得られたpBS4 YggB66を実施例6記載の方法と同様にATCC17965株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、66型に置換されていた株を選択することで、66型変異を有する株を構築できる。このような変異を持つ66型変異株をyggB66株とする。」(段落【0130】)

ス.「【実施例13】
【0131】
<in vitro変異による変異型yggB遺伝子のスクリーニング>
(13-1)yggB欠損株の構築
変異型のyggB遺伝子をin vitroでyggBに変異をランダムに導入し、その中から界面活性剤等の添加なしにグルタミン酸生産が可能となるクローンを選択することも出来る。変異型遺伝子のスクリーニングを行うため、まずyggB欠損株を構築した。配列番号39に示す合成DNAと配列番号40に示す合成DNAをプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製した。同様に配列番号41と配列番号42の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製した。配列番号40と41は互いに相補的である。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号39と配列番号42の合成DNAをプライマーとしてPCRを行ないyggB遺伝子のORFを欠失した断片を取得した。
【0132】
得られたPCR断片はSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、欠損変異導入用のプラスミドを構築した。このようにして得られたpBS4ΔYggBを実施例6記載の方法でATCC13869株の染色体に挿入した後、脱落させた。得られたカナマイシン感受性株の染色体DNAを鋳型として、配列番号39と配列番号42の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、yggB遺伝子が欠損していることを確認した。得られたyggB遺伝子欠損株をATCC13869ΔyggB株とした。
【0133】
(13-2)変異型yggB遺伝子のin vitro スクリーニング
一方、yggB遺伝子の変異処理は以下のようにして行った。まず、プラスミドpL5kはyggB遺伝子以外の領域を若干含んでいるため、pL5kをXhoIとSalIで処理し、セルフライゲーションすることにより、プラスミドpL5kXSを得た。なおSalI認識部位は、配列番号5の塩基配列上には存在しないが、pBS3のマルチクローニングサイトに存在している。得られたpL5kXS約10μgを500mMリン酸緩衝液、400mMヒドロキシルアミン、1mM EDTA (pH6.0)に溶解し、75℃で30分から90分処理することにより変異を導入した。変異導入後のプラスミドは、SUPREC-02(タカラバイオ)で脱塩した後、実施例6記載の方法でATCC13869ΔyggB株に導入し、Km25μg/mlを含むCM2B培地で形質転換体を選択した。また、対照として変異処理前のpL5kXSについてもATCC13869ΔyggB株に導入した。出現した形質転換体を、CM2BGU2培地(実施例3記載のCM2B培地にグルコース10g/Lと15g/LのUreaを含む)2mlの液体培地に接種し、31.5℃で5時間しんとう培養したのち、グルタミン酸濃度を定量した。
表11に、ATCC13869ΔyggBを変異処理したpL5kXSで形質転換した株をCM2BGU2培地にて試験管培養評価した結果を示す。変異処理時間60分と90分のプラスミド混合物から得られた形質転換体の中には、1g/L以上のL-グルタミン酸を蓄積するクローンが3クローンが存在していた。なお、培地中にもともと含まれていたグルタミン酸は0.16g/Lであり、ATCC13869ΔyggB/pL5kXS(変異処理なし)のグルタミン酸蓄積量は0.31g/Lであった。
表12に、ATCC13869ΔyggBを変異処理したpL5kXSで形質転換した株をCM2BGU培地(Ureaが1.5g/Lである以外はCM2BGU2培地と同組成)にて試験管培養評価した結果を示す。変異処理時間90分のプラスミド混合物から得られた形質転換体の中に、1g/L以上のL-グルタミン酸を蓄積するクローンが1クローン存在していた。
・・・・・・・・・・・・
【0136】
表11において、60分の変異処理時間を行うことで1g/L以上のL-グルタミン酸を蓄積する生産能を獲得したプラスミドをpL5kXSm-22,表12において、90分の変異処理時間を行うことで0.9g/L以上のL-グルタミン酸生産能を獲得したプラスミドをpL5kXSm-27とした。ATCC13869ΔyggB/pL5kXS株、ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-27株、ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-22株を、実施例2記載の条件で培養し、4時間後の菌体量とL-グルタミン酸蓄積を分析した。表13に、独立した3回の実験による平均値を示した。ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-27株、ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-22株では有意にL-グルタミン酸蓄積が上昇していることが確認でき、in vitroでのランダムな変異導入によってもL-グルタミン酸に有利な変異型遺伝子が構築可能であることが示された。なお、pL5kXSm-22が含むyggB遺伝子の配列は、配列番号73に示した。(22型変異)
22型変異は、437番目のプロリンをセリンに置換する変異であり、例えば配列番号5の2745位のCをTに置換する変異である。また、本変異は、3060位のCをTに置換する変異を伴っている。この変異型yggB遺伝子を配列番号73に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号74に示す。
【0137】
【表13】

【0138】
(13-3)変異型遺伝子のコリネ型細菌への導入とL-グルタミン酸生産確認
(13-2)で得られた新規変異型yggB遺伝子をコリネ型細菌に導入する。導入方法は、実施例6に記載された方法でpBS4Sに変異型遺伝子を導入し、ATCC13869の染色体上の野生型のyggB遺伝子と置換した。この新規変異型遺伝子を導入した株と親株のATCC13869株を実施例2と同様の方法で培養を行う。培養終了後、培養液中に含まれるL-グルタミン酸の量を公知の方法で測定し、変異導入株がL-グルタミン酸の蓄積が向上していることを確認する。このような方法でL-グルタミン酸生産能の向上したyggB変異株を取得することが出来る。」(段落【0131】?【0138】)

セ.「【実施例14】
【0139】
<変異型yggB遺伝子保持株のグルタミン酸アナログ感受性>
(14-1)固体培地における4-フルオログルタミン酸感受性
yggB変異によってL-グルタミン酸の生産能が向上している株では、L-グルタミン酸アナログ感受性が低下していることが予測された。そこで、yggB変異によるL-グルタミン酸のアナログとして、4-フルオログルタミン酸に対する感受性の変化を検討した。実施例4記載の最少培地に、NaOHでpH6.7に調整しフィルター滅菌した4-フルオログルタミン酸を終濃度7.5mMとなるように添加した。ATCC13869株、ATCC13869-L30株、ATCC13869-A1株をCM-Dex培地に塗布して一夜培養した後集菌し、滅菌した0.85%のNaCl溶液で洗浄し、図6上部に記載の菌濃度となるように希釈してプレートにスポットした。プレートは31.5℃で培養し、その経時変化を図6に示した。4-フルオログルタミン酸を無添加の条件では、ATCC13869株が最も生育が速いのに対し、4-フルオログルタミン酸添加条件ではATCC13869株の生育が抑えられ、ATCC13869-L株およびATCC13869-A1株の方が生育が良好であることが示された。
【0140】
(14-2)液体培地における4-フルオログルタミン酸感受性
実施例4記載の最少培地(ただし寒天を含まない)に、NaOHでpH6.7に調整しフィルター滅菌した4-フルオログルタミン酸を終濃度1.25mM, 2.5mM, 5mM, 10mM, 20mMとなるように添加した。ATCC13869株、ATCC13869ΔyggB株、ATCC13869-L30株、ATCC13869-A1株をCM-Dex培地に塗布して31.5℃で一夜培養した後集菌し、滅菌した0.85%のNaCl溶液で洗浄し、液体培地に接種し31.5℃にて振とう培養した。各菌株において、4-フルオログルタミン酸を無添加の培地でのOD660の値が1に到達した時点で培養を終了し、培養液を適当に希釈してCM-Dexプレートに塗布した。翌日出現したコロニー数を計測し、液体培養終了時の生菌数とした。4-フルオログルタミン酸無添加区の生菌数を1として、4-フルオログルタミン酸添加による相対生菌数の変化を図7に示した。ATCC13869-A1株およびATCC13869-L30株では、4-フルオログルタミン酸に対する感受性が低下(4フルオログルタミン酸耐性が向上)していることが明らかとなった。
これらの結果から、4-フルオログルタミン酸等、グルタミン酸の構造類縁体の感受性を指標としたスクリーニングによっても本発明のyggB変異株が取得できることが示された。」(段落【0139】?【0140】)

(2)本件訂正発明の課題
本件訂正発明の課題は、コリネ型細菌を用いたL-グルタミン酸の製造において、L-グルタミン酸生産能力を向上させる新規な技術を提供することである(上記記載内容ア.)。

(3)本件明細書の実施例8の実験結果について
請求人は、本件訂正発明11について、本件明細書の実施例8において、野生株であるATCC13869と19型yggB変異株であるATCC13869-19とのグルタミン酸生産量が比較されているが、グルタミン酸の生産量は、ATCC13869では0.5g/L、ATCC13869-19では0.7g/Lであり(表7)、両者の差(0.2g/L)は、実施例2及び3の測定結果の数値からすると、誤差の範囲内にすぎず、ATCC13869-19によってL-グルタミン酸の生産能力が向上したとはいえない、また、甲28号証、甲第34号証を提示して、本件明細書の実施例8の条件(Tween40添加またはビオチン制限を課さない条件)では、野生株ATCC13869も19型変異株であるATCC13869-19も、L-グルタミン酸を生産しなかったのに対し、Tween40添加またはビオチン制限の条件で初めてATCC13869-19はL-グルタミン酸を生産したことから、本件訂正発明11は、「L-グルタミン酸生産能力を向上させる新規な手段を提供する」という課題が解決できない範囲に及ぶ、また、発明の詳細な説明は、当業者がL-グルタミン酸の生産能力を向上させて発明を実施できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
しかしながら、本件明細書の実施例8の実験結果については、各菌株培養後のグルタミン酸濃度は、野生株が0.5g/Lであるのに対し、19型yggB変異株は0.7g/Lを示しており(上記記載内容のク.の表7)、19型YggB変異の導入によりグルタミン酸生産能が野生型の1.4倍になったことが明確に記載されており、また、実施例8には、「ATCC13869-19株と親株のATCC13869株を実施例2と同様の方法で培養を行った。」と記載されている(上記記載内容ク.の【0120】)ものの、実施例2と実施例8とは別々に行われた実験であり、実施例8の実験では、実施例8の「ATCC13869株」と実施例8の「ATCC13869-19株」とは、用いた菌株が異なるという点以外はすべて同1条件下で実験が行われたものと認められ、その測定結果の数値を比較することができるが、実施例2の「ATCC13869株」と実施例8の「ATCC13869株」とは、必ずしもそうとはいえないから、実施例2及び3の測定結果の数値は、実施例8とは別に行われた実験において測定された数値であり、その数値を根拠に実施例8の実験結果を誤差の範囲内にすぎないということはできず、それ以外に「両者の差(0.2g/L)は、誤差の範囲内にすぎ」ないことを裏付ける証拠は何ら提出されていないので、本件明細書の実施例8の実験結果は、19型YggB変異体によるコリネ型細菌のグルタミン酸生産能の向上を示したものであるといえるから、発明の詳細な説明は、当業者がL-グルタミン酸の生産能力を向上させて発明を実施できる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。また、この実施例8の結果は、非誘導条件下での再現実験により複数回再現されており(乙第6号証の実験1及び2の結果参照)、このことからも、実施例8の実験結果は、19型YggB変異体の導入によるコリネ型細菌のグルタミン酸生産能の向上を示したものであるといえる。
また、甲第28号証、甲第34号証の実験結果は、「三角フラスコ」を用いた低速での撹拌培養による実験結果であって、そもそも本件明細書には、「三角フラスコ」を用いて培養を行うことは全く記載されておらず、本件明細書に記載されている「坂口フラスコ」を用いて、本件明細書の実施例8の実験条件に沿った実験を行っても、本件明細書の実施例8の実験結果が再現できなかった証拠は提出されていないので、甲第28号証、甲第34号証の記載事項が、本件訂正発明11は、「L-グルタミン酸生産能力を向上させる新規な手段を提供する」という課題が解決できない範囲に及ぶことの根拠になるとはいえない。
よって、本件訂正発明11は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明11の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。

(4)コリネ型細菌の培養条件について
請求人は、本件訂正発明11について、本件明細書の実施例10によると、Tween40を添加した条件またはビオチン制限条件という特定の条件下に限り、ATCC13869-19のL-グルタミン酸生産量がATCC-13869と比較して向上したことから、「L-グルタミン酸生産能力を向上させる新規な手段を提供する」という課題は、Tween40を添加した条件又はビオチン制限条件下でのみ解決できるといえるが、本件訂正発明11には、これらの条件が加えられておらず、通常の培養による製造法が記載されているにすぎないから、本件訂正発明11は、上記課題が解決できない範囲に及ぶ、また、発明の詳細な説明は、当業者がTween40添加又はビオチン制限なしでもL-グルタミン酸の生産能力を向上させて発明を実施できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
しかしながら、本件訂正発明は、上記課題を解決するための手段として、「yggB遺伝子がコリネ型細菌のL-グルタミン生産に関与していることを明らかにし、yggB遺伝子を用いてコリネ型細菌を改変することにより、L-グルタミン酸の生産能が大幅に向上することを見出し」たものであり(上記記載内容ア.)、コリネ型細菌の培養条件といった好適条件は発明特定事項として課題解決に必ずしも必要な事項ではなく、また、本件明細書の実施例10は、Tween40を添加した条件またはビオチン制限条件というL-グルタミン酸生成を誘導できる条件を試験した実験であり(上記記載内容コ.)、その条件下でしかL-グルタミン酸生産量の向上が見られないことを示すものではなく、上記(3)で述べたように、実施例8の実験結果は、非誘導条件下で19型YggB変異体によるコリネ型細菌のグルタミン酸生産能の向上を示したものといえる(上記記載内容エ.及びク.)から、本件訂正発明11は、「L-グルタミン酸生産能力を向上させる新規な手段を提供する」という課題が解決できない範囲に及ぶとはいえず、また、発明の詳細な説明は、当業者がTween40添加又はビオチン制限なしでもL-グルタミン酸の生産能力を向上させて発明を実施できる程度に明確かつ十分に記載されていないともいえない。
よって、本件訂正発明11は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明11の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。

(5)2A-1型変異(本件訂正発明1の(i)及び(i’)の変異)について
請求人は、本件訂正発明1について、本件訂正発明1の(i)の変異が導入されたコリネ型細菌及びそのL-グルタミン酸の生産性は発明の詳細な説明には記載されておらず、また、発明の詳細な説明において、本件訂正発明1の(i’)の変異が導入され、L-グルタミン酸の生産性向上が実際に確認されたコリネ型細菌は、配列番号6の419番目から下流のアミノ酸が欠失され、そのC末端側に5つのアミノ酸(Gly-Leu-Phe-Leu-Phe)よりなるISが挿入された変異yggB(配列番号8のアミノ酸配列)が導入されたコリネ型細菌のみであり(実施例5及び6、表4及び表5)、419-529番目の領域の任意の位置に任意の長さ及び配列のIS又はトランスポゾンが挿入された変異yggBを有するコリネ型細菌を取得したこと、及びそのL-グルタミン酸の生産能を確認したことは具体的に示されていないので、このような変異yggBを有するコリネ型細菌が、上記実施例に示された変異yggB(配列番号8)を有するコリネ型細菌と同等のL-グルタミン酸の生産性を有すると理解することはできないから、当業者は、本件明細書の記載から、本件訂正発明1の(i)及び(i’)の変異により、L-グルタミン酸の生産能力向上という課題が解決できることを認識できず、また、発明の詳細な説明は、本件訂正発明1の(i)及び(i’)の変異により、L-グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
しかしながら、本件明細書の実施例5及び6には、配列番号6のアミノ酸配列のアミノ酸番号419から下流部分のC末端側にトランスポゾンにより挿入されたIS(インサーションシークエンス)である5個のアミノ酸が挿入された2A-1型変異が開示され、当該変異を導入したコリネ型細菌のグルタミン酸生産能の向上を確認したことが記載されており(上記記載内容オ.及びカ.)、この2A-1型変異は、配列番号6のアミノ酸配列のアミノ酸番号419?533のYggBタンパク質のC末端側領域が欠失し、5個のアミノ酸に置換されたものであり、その変異の態様からすれば、実質的にはYggBタンパク質のアミノ酸番号419以降のC末端領域が欠失した変異であるといえるから、当業者であれば、実施例5及び6の記載から、YggBタンパク質のアミノ酸番号419以降のC末端領域が欠失した変異について同様の効果が得られることを認識できるものであり、また、当業者であれば、実施例5及び6の結果は、YggBタンパク質のアミノ酸番号419以降のC末端領域の立体構造が改変されることで生じたものと理解することができるから、YggBタンパク質のアミノ酸番号419以降のC末端領域にIS又はトランスポゾンの挿入を導入したコリネ型細菌について、アミノ酸番号419以降のC末端領域の立体構造が改変された場合には、本件明細書の上記実施例に記載の変異と同様の効果が得られることを認識できるので、当業者であれば、本件明細書の上記実施例の記載(上記記載内容オ.及びカ.)及び本件明細書の記載(上記記載内容イ.)から、本件訂正発明1の(i)及び(i’)の変異により、L-グルタミン酸の生産能力向上という課題が解決できることを認識でき、また、発明の詳細な説明は、本件訂正発明1の(i)及び(i’)の変異により、L-グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
よって、本件訂正発明1の(i)及び(i’)の変異について、本件訂正発明1は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明1の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。

(6)66型変異、22型変異(本件訂正発明1の(i’’)の変異)について
請求人は、本件訂正発明1について、発明の詳細な説明において、本件訂正発明1の(i’’)の変異が導入され、L-グルタミン酸の生産性が実際に確認されているコリネ型細菌は、437番目のプロリンがセリンに置換された変異yggB(配列番号74のアミノ酸配列)が導入されたコリネ型細菌のみであり(実施例13)、配列番号68の424番目のプロリンがロイシンに置換された変異yggB(配列番号70のアミノ酸)が導入されたコリネ型細菌(実施例12)については、L-グルタミン酸の生産性は確認されておらず、配列番号6等の419-533又は419-529の領域に存在する任意のプロリンの1つ以上をその他の任意のアミノ酸に置換した場合に、実施例13に示された具体例(437番目のプロリンをセリンに置換、配列番号74)と同様にL-グルタミン酸の生産性が向上することを認識できず、また、発明の詳細な説明は、本件訂正発明1の(i’’)の変異により、L-グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
しかしながら、本件明細書の実施例12及び13には、アミノ酸番号424のプロリンがロイシンに置換された66型変異を導入したコリネ型細菌を構築したことが記載され(上記記載内容シ.)、アミノ酸番号437のプロリンがセリンに置換された22型変異を導入したコリネ型細菌を構築したこと、そのL-グルタミン酸生産能が向上したことが記載されており(上記記載内容ス.)、また、配列番号6等のアミノ酸配列のアミノ酸番号419-533の領域に存在するプロリンの位置については、本件明細書の段落【0072】に具体的に記載されている(上記記載内容イ.)から、当業者であれば、本件明細書の上記実施例の記載(上記記載内容シ.及びス.)及び本件明細書の記載(上記記載内容イ.)に従って、配列番号6等のアミノ酸配列のアミノ酸番号419-533の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異を導入したコリネ型細菌を構築し、その中からL-グルタミン酸の生産能が向上したコリネ型細菌を取得することに、当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行う必要があると認められないから、発明の詳細な説明は、本件訂正発明1の(i’’)の変異を有する変異型yggB遺伝子が導入され、L-グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌に係る発明について、当業者がその実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
また、本件明細書には、上述の如く、配列番号6等のアミノ酸配列のアミノ酸番号419-533の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異を導入したコリネ型細菌がL-グルタミン酸の生産能を向上させることができた実施例が少なくとも1つ存在し、また、本件明細書の段落【0072】には、yggB遺伝子のC末端側のプロリン残基は、YggBタンパク質の立体構造維持の為に重要な役割を果たしていると考えられることが記載されている(上記記載内容イ.)から、当業者であれば、本件明細書の上記実施例の記載(上記記載内容シ.及びス.)及び本件明細書の記載(上記記載内容イ.)、並びにタンパク質の構造におけるプロリンの役割についての乙第19号証等の記載から、配列番号6等のアミノ酸配列のアミノ酸番号419-533の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異を導入したコリネ型細菌について、アミノ酸番号419以降のC末端領域の立体構造が改変された場合には、本件明細書の上記実施例に記載の変異と同様の効果が得られることを認識でき、L-グルタミン酸生産能の向上という課題が解決できることが認識できるといえるから、本件訂正発明1の(i’’)の変異を有する変異型yggB遺伝子が導入され、L-グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌に係る発明は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではない。
よって、本件訂正発明1の(i’’)の変異について、本件訂正発明1は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明1の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。

(7)膜貫通領域の変異(本件訂正発明1の(ii)の変異)について
請求人は、本件訂正発明1について、配列番号6等のアミノ酸配列のアミノ酸1-23番目の領域での変異について、コリネ型細菌へ変異を導入し、L-グルタミン酸の生産性が実際に確認されているのは、14番目のロイシンと15番目のトリプトファンの間に3アミノ酸からなるIS(Cys-Ser-Leu)が挿入された1例に過ぎず(実施例7)、当該1-23番目でのアミノ酸の置換や欠失については具体的に示されておらず、配列番号6等のアミノ酸配列の1-23番目において、1?5個の任意のアミノ酸を任意のアミノ酸で置換または欠失させた場合、任意の位置に1?5個の任意のアミノ酸を挿入した場合に実施例7に示された具体例と同様に、L-グルタミン酸の生産性が向上することを当業者は認識することができない、また、配列番号6等のアミノ酸配列のアミノ酸86-108番目の領域での変異について、コリネ型細菌へ変異を導入し、L-グルタミン酸の生産性が実際に確認されているのは、100番目のアラニンをスレオニンに置換した1例に過ぎず(実施例8)、当該86-108番目でのアミノ酸の挿入や欠失については具体的に示されておらず、配列番号6等のアミノ酸配列の86-108番目において、1?5個の任意のアミノ酸を任意のアミノ酸で置換または欠失させた場合、任意の位置に1?5個の任意のアミノ酸を挿入した場合に、実施例8に示された具体例と同様にL-グルタミン酸の生産性が向上することを当業者は認識することができない、さらに、配列番号6等のアミノ酸配列の111-132番目の領域での変異について、コリネ型細菌へ変異を導入し、L-グルタミン酸の生産性が実際に確認されているのは、111番目のアラニンをバリンに置換した1例に過ぎず(実施例9及び11)、当該111-132番目でのアミノ酸の挿入や欠失については具体的に示されておらず、配列番号6等のアミノ酸配列の111-132番目において、1?5個の任意のアミノ酸を任意のアミノ酸で置換または欠失させた場合、任意の位置に1?5個の任意のアミノ酸を挿入した場合に、実施例9及び11に示された具体例と同様にL-グルタミン酸の生産性が向上することを当業者は認識することができない、また、発明の詳細な説明は、本件訂正発明1の(ii)の変異により、L-グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
しかしながら、本件明細書の実施例7?9及び11には、14番目のロイシンと15番目のトリプトファンの間に3アミノ酸からなるIS(Cys-Ser-Leu)が挿入されたA1型変異を導入したコリネ型細菌を構築し、そのL-グルタミン酸生産能が向上したことが記載され(上記記載内容キ.)、100番目のアラニンがスレオニンに置換された19型変異を導入したコリネ型細菌を構築したこと、そのL-グルタミン酸生産能が向上したことが記載されており(上記記載内容ク.)、111番目のアラニンがバリンに置換されたL30型変異を導入したコリネ型細菌を構築したこと、そのL-グルタミン酸生産能が向上したことが記載されており(上記記載内容ケ.)、111番目のアラニンがスレオニンに置換された8型変異を導入したコリネ型細菌を構築したことが記載されており(上記記載内容サ.)、また、配列番号6等のアミノ酸配列のアミノ酸番号1-23、86-108、110-132の領域は、23個のアミノ酸からなるアミノ酸配列という限定された領域であり、さらに、訂正請求により、アミノ酸番号1-23、86-108、110-132の領域に導入されるアミノ酸の置換、欠失、又は挿入の個数は1?5個に限定されているから、当業者であれば、本件明細書の上記実施例の記載(上記記載内容キ.?ケ.及びサ.)及び本件明細書の記載(上記記載内容イ.)に従って、配列番号6等のアミノ酸配列のアミノ酸番号1-23、86-108、及び110-132からなる群から選ばれる領域において、1?5個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入した変異を導入したコリネ型細菌を構築し、その中からL-グルタミン酸の生産能が向上したコリネ型細菌を取得することに、当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行う必要があると認められないから、発明の詳細な説明は、本件訂正発明1の(ii)の変異を有する変異型yggB遺伝子が導入され、L-グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌に係る発明について、当業者がその実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
また、本件明細書には、上述の如く、配列番号6等のアミノ酸配列のアミノ酸番号1-23、86-108、110-132の領域における1?5個のアミノ酸の変異を導入したコリネ型細菌がL-グルタミン酸の生産能を向上させることができた実施例がそれぞれ少なくとも1つ存在し、また、配列番号6等のアミノ酸配列のアミノ酸番号1-23、86-108、110-132の領域は、23個のアミノ酸からなるアミノ酸配列という限定された領域で、かつ、上記実施例の変異の位置の近傍の領域であり、さらに、訂正請求により、アミノ酸番号1-23、86-108、110-132の領域に導入されるアミノ酸の置換、欠失、又は挿入の個数は1?5個に限定されているから、当業者であれば、本件明細書の上記実施例の記載(上記記載内容キ.?ケ.及びサ.)及び本件明細書の記載(上記記載内容イ.)から、配列番号6等のアミノ酸配列のアミノ酸番号1-23、86-108、及び110-132からなる群から選ばれる領域において、1?5個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入した変異を導入したコリネ型細菌について、L-グルタミン酸生産能の向上という課題が解決できることが認識できるといえるから、本件訂正発明1の(ii)の変異を有する変異型yggB遺伝子が導入され、L-グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌に係る発明は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではない。
よって、本件訂正発明1の(ii)の変異について、本件訂正発明1は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明1の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。

(8)配列番号85のアミノ酸配列について
請求人は、本件訂正発明1について、発明の詳細な説明において、野生型yggBタンパク質として具体的に示されているのは、配列番号6、68、84及び62のみであり、配列番号6の複数箇所(48番目、275番目、298番目、343番目、396番目、438番目、445番目、454番目、457番目、474番目及び517-520番目)のアミノ酸に対して、任意のアミノ酸への置換又は欠失を行ったことは具体的に示されていないので、配列番号6の上記複数箇所において、任意のアミノ酸で置換した場合や欠失させた場合に、yggBタンパク質として機能するのか当業者は認識することができないし、そのような置換や欠失が導入されたアミノ酸配列に対して、本件訂正発明1の(i)、(i’)、(i’’)又は(ii)の変異をさらに導入した場合に、L-グルタミン酸の生産性が向上することを当業者は認識することができず、また、発明の詳細な説明は、配列番号85のアミノ酸配列に対して、本件訂正発明1の(i)、(i’)、(i’’)又は(ii)の変異を導入することにより、L-グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
しかしながら、配列番号85のアミノ酸配列は、コリネ型細菌に保存されるYggBタンパク質のアミノ酸配列を示したものであり、配列番号6等で示すYggBタンパク質のアミノ酸配列のうち、アミノ酸置換・欠失が起こっていてもよい箇所をXaaで示したものである(本明細書の段落【0035】?【0036】、上記記載内容イ.の【0078】?【0079】、等)から、配列番号85のアミノ酸配列についても、他の配列番号のアミノ酸配列と同様にYggBタンパク質としての機能を有すると当業者は認識することができるし、また、本件訂正発明1の(i)、(i’)、(i’’)又は(ii)の変異を導入した場合についても、上記(5)?(7)で述べたように、L-グルタミン酸の生産能力向上という課題が解決できることを認識することができ、発明の詳細な説明は、L-グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
よって、配列番号85のアミノ酸配列について、本件訂正発明1は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明1の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。

(9)本件訂正発明2について
請求人は、本件訂正発明2について、発明の詳細な説明において、本件訂正発明2の変異が導入され、L-グルタミン酸の生産性が実際に確認されているコリネ型細菌は、437番目のプロリンがセリンに置換された変異yggB(配列番号74のアミノ酸配列)が導入されたコリネ型細菌のみであり(実施例13)、配列番号68の424番目のプロリンがロイシンに置換された変異yggB(配列番号70のアミノ酸)が導入されたコリネ型細菌(実施例12)については、L-グルタミン酸の生産性は確認されておらず、配列番号6等の424番目及び/又は437番目のプロリンをその他のアミノ酸に置換(424番目のプロリンについて、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、又はイソロイシンに置換;437番目のプロリンについて、スレオニン、セリン、又はチロシンに置換)した場合に、実施例13に示された具体例(437番目のプロリンをセリンに置換、配列番号74)と同様に、L-グルタミン酸の生産性が向上することを認識できず、本件訂正発明2は、発明の詳細な説明に記載されたものではない、また、発明の詳細な説明は、本件訂正発明2の変異により、L-グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
しかしながら、上記(6)で述べた理由と同様の理由に加えて、さらに、訂正請求により、訂正後の請求項2は、「前記(i’’)の変異は、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、424位のプロリンをアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなる群から選ばれる1個のアミノ酸に置換し、及び/または437位のプロリンをスレオニン、セリン及びチロシンからなる群から選ばれる1個のアミノ酸に置換する変異である」のように、424位または437位のプロリンから置換されるアミノ酸が限定されているから、本件訂正発明2の変異について、L-グルタミン酸の生産能力向上という課題が解決できることを認識することができ、また、発明の詳細な説明は、L-グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
よって、本件訂正発明2は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明2の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。

(10)本件訂正発明4について
請求人は、本件訂正発明4について、本件明細書には、配列番号6等のアミノ酸における111位のアラニンをスレオニンに置換した変異が導入されたコリネ型細菌及びそのL-グルタミン酸の生産性、配列番号6等のアミノ酸における100位のアラニンをスレオニンに置換する変異が導入されたコリネ型細菌及びそのL-グルタミン酸生産性、111位のアラニンをスレオニンもしくはバリンに置換する変異が導入されたコリネ型細菌及びそのL-グルタミン酸生産性についての実施例は記載されていないので、本件訂正発明4の全範囲において、実施例8、9または11に示された具体例と同様のL-グルタミン酸生産性が達成されることを当業者は認識できず、本件訂正発明4は、発明の詳細な説明に記載されたものではない、また、発明の詳細な説明は、本件訂正発明4の変異により、L-グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
しかしながら、上記(7)で述べた理由と同様の理由に加えて、さらに、訂正請求により、訂正後の請求項4は、「前記変異型yggB遺伝子の変異は、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、100位のアラニンをスレオニンに、及び/または111位のアラニンをスレオニン又はバリンに置換する変異である」のように、100位または111位のアラニンから置換されるアミノ酸が限定されているから、本件訂正発明4の変異について、L-グルタミン酸の生産能力向上という課題が解決できることを認識することができ、また、発明の詳細な説明は、L-グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
よって、本件訂正発明4は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明4の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。

(11)本件訂正発明5について
請求人は、本件訂正発明5について、配列番号6等の14位のロイシンと15位のトリプトファンの間に挿入される1?5個の任意のアミノ酸の組み合わせは膨大であり、タンパク質を構成する各アミノ酸は、タンパク質の2次構造の形成や3次元構造の安定化に関わり、タンパク質の機能発現に大きく影響することが知られているから、本件訂正発明5の全範囲において、実施例7に示された僅か1つの具体例と同様に、L-グルタミン酸の生産性が向上することを当業者は認識することはできず、本件訂正発明5は、発明の詳細な説明に記載されたものではない、また、発明の詳細な説明は、本件訂正発明5の変異により、L-グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
しかしながら、上記(7)で述べた理由と同様の理由に加えて、さらに、訂正請求により、訂正後の請求項5は、「前記変異型yggB遺伝子の変異は、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、14位のロイシンと15位のトリプトファンの間に1?5アミノ酸を挿入する変異である」のように、14位のロイシンと15位のトリプトファンの間に挿入されるアミノ酸の個数は1?5個に限定されているから、本件訂正発明5の変異について、L-グルタミン酸の生産能力向上という課題が解決できることを認識することができ、また、発明の詳細な説明は、L-グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
よって、本件訂正発明5は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明5の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。

(12)本件訂正発明6について
請求人は、本件訂正発明6について、配列番号8、20、22、24、64、70、74のアミノ酸配列に1?5個の更なる変異が導入されたアミノ酸配列、それをコードする遺伝子、及び当該変異によるL-グルタミン酸の生産性に関して、本件明細書は実質的に記載していないが、タンパク質を構成する各アミノ酸は、タンパク質の2次構造の形成や3次元構造の安定化に関わり、タンパク質の機能発現に大きく影響することが知られているから、配列番号8、20、22、24、64、70、74のアミノ酸配列において、1?5個の任意のアミノ酸について置換または欠失を行った場合、あるいは任意の部位に1?5個の任意のアミノ酸を挿入または付加した場合に、どのような変異タンパク質が、過剰量のビオチンを含む培地中でL-グルタミン酸の生産性向上をもたらすのか理解することはできないので、本件訂正発明6は、発明の詳細な説明に記載されたものではない、また、発明の詳細な説明は、本件訂正発明6により、L-グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
しかしながら、配列番号8、20、22、24、64、70、74のアミノ酸配列を有するタンパク質は、それぞれ423個、536個、533個、533個、529個、533個、533個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するタンパク質であるから、423個、536個、533個、533個、529個、533個、533個のアミノ酸のうちの、1?5個程度の任意のアミノ酸を置換または欠失させた場合や任意の部位に1?5個程度の任意のアミノ酸を挿入または付加させた場合に、元のタンパク質の活性を失わない蓋然性が高いことは本件出願時の技術常識であり、また、当業者であれば、本件明細書の記載から、変異を導入するとYggBタンパク質の活性が失われてしまうようなアミノ酸の位置等については理解することが可能であるから、本件訂正発明6について、L-グルタミン酸の生産能力向上という課題が解決できることを認識することができ、また、発明の詳細な説明は、L-グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
よって、本件訂正発明6は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明6の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。

(13)本件訂正発明7について
請求人は、本件訂正発明7について、本件明細書には、配列番号20の変異型yggBが導入されたATCC13869-A1株及び配列番号22の変異型yggBが導入されたATCC13869-L30株が、4-フルオログルタミン酸の感受性を低下させたことが確認されている(実施例14)に過ぎず、4-フルオログルタミン酸に対する耐性に関する結果から、L-グルタミン酸アナログに包含される全ての化合物に対してコリネ型細菌がどのような耐性を有するのか理解することできないから、本件訂正発明7に包含される極めて広範なコリネ型細菌のいずれもが、様々な化合物が広く包含されるL-グルタミン酸アナログ一般に対して耐性を向上させることは認識できず、本件訂正発明7は、発明の詳細な説明に記載されたものではない、また、発明の詳細な説明は、本件訂正発明7のコリネ型細菌がL-グルタミン酸アナログ耐性を向上させることが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
しかしながら、本件明細書の実施例14には、変異型yggB遺伝子の導入により、グルタミン酸アナログである4-フルオログルタミン酸耐性が向上した菌株を取得した(上記記載内容セ.)ことが記載され、この実施例14では、A1型変異、L30型変異の変異型yggB遺伝子が導入された2種の菌株がグルタミン酸アナログ耐性を有していたことが開示されており、当業者であれば、複数の変異型yggB遺伝子導入菌株の結果が開示された本件明細書の上記実施例の記載及び本件明細書の記載(上記記載内容ウ.)を踏まえ、変異型yggB遺伝子の導入により、グルタミン酸アナログに耐性を有する菌株を取得できることを認識できるから、本件訂正発明7は、発明の詳細な説明に記載されたものではないとはいえず、また、複数の変異型yggB遺伝子導入菌株の結果が開示された本件明細書の上記実施例の記載及び本件明細書の記載(上記記載内容ウ.)から、変異型yggB遺伝子の導入により、グルタミン酸アナログに耐性を有する菌株を取得できることは当業者であれば理解することができるから、発明の詳細な説明は、本件訂正発明7のコリネ型細菌がL-グルタミン酸アナログ耐性を向上させることが理解できる程度に明確かつ十分に記載されていないとはいえない。
よって、本件訂正発明7は、発明の詳細な説明に記載されたものといえ、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明7の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。

(14)本件訂正発明10について
本件訂正発明10は、本件訂正発明1?2、4?7に更なる限定を加えた発明であるから、上記(5)?(13)で述べたように、本件訂正発明1?2、4?7は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明1?2、4?7の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる以上、本件訂正発明10は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明10の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。

(15)本件訂正発明11について
請求人は、本件特許の請求項11に係る発明について、コリネ型細菌を培地で培養し、L-グルタミン酸を該培地中に生成させること、及び菌体からL-グルタミン酸を回収することについては、本件明細書には記載されておらず、また、発明の詳細な説明は、本件特許の請求項11に記載の方法により、L-グルタミン酸を製造ができる程度に明確かつ十分に記載されていない、と主張している。
しかしながら、訂正請求により、請求項11は、「コリネ型細菌を培地で培養し、L-グルタミン酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地からL-グルタミン酸を回収する」に訂正され、L-グルタミン酸の生成蓄積及び回収は、培地からのみとしているので、本件訂正発明11は、発明の詳細な説明に記載されたものといえ、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明11の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。

(16)本件訂正発明12について
本件訂正発明12は、本件訂正発明6に記載の変異型yggB遺伝子と実質的に同一の変異型yggB遺伝子に係る発明であるから、上記(12)で述べたように、本件訂正発明6は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明6の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる以上、本件訂正発明12は、発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく、また、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明12の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。

(17)まとめ
したがって、本件発明の詳細な説明は、当業者が本件訂正発明1?2、4?7、10?12の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえるから、本件発明の詳細な説明の記載は、特許法第36条第4項第1号に規定する要件を満たしていない、とすることはできず、また、本件訂正発明1?2、4?7、10?12は、発明の詳細な説明に記載されたものといえるから、本件特許請求の範囲の記載は、特許法第36条第6項第1号に規定する要件を満たしていない、とすることはできない。

3.無効理由6(明確性要件)について
(1)本件訂正発明6、12の記載について
請求人は、本件訂正発明6、12の記載について、「過剰量のビオチン」という記載において、「過剰量」とはいかなる量をいうのか不明であるから、本件訂正発明6、12は、明確に記載されているとはいえない、と主張している。
しかしながら、本件明細書の段落【0032】には、「過剰量のビオチン」について、「「過剰量のビオチンを含む条件」とは、例えば、培地中にビオチンを30μg/L以上、好ましくは40μg/L、さらに好ましくは50μg/L含む条件をいう。」と記載されており、本件明細書の記載及び出願時の技術常識を考慮すれば、「過剰量のビオチン」という記載の意味内容を理解することができるから、本件訂正発明6、12は、明確に記載されているといえる。

(2)本件訂正発明7の記載について
請求人は、本件訂正発明7の記載について、コリネ型細菌が「L-グルタミン酸アナログ耐性が向上したことを特徴とする」と記載されているが、「L-グルタミン酸アナログ」にはどのような物質が具体的に包含されるのか、その範囲が明らかでないから、本件訂正発明7は、明確に記載されているとはいえない、と主張している。
しかしながら、本件明細書の段落【0068】には、「L-グルタミン酸アナログ」について、「L-グルタミン酸アナログとしては、L-グルタミン酸-γ-メチルエステル、α-メチルグルタミン酸、β-ヒドロキシグルタミン酸、メチオニンスルホキシミン、グルタミン酸-γ-モノヒドロキサメ-ト、2-アミノ-4-ホスホノ酪酸、L-グルタミン酸-γ-モノエチルエステル、L-グルタミン酸ジメチルエステル、L-グルタミン酸-ジ-t-ブチルエステル、モノフロログルタミン酸、L-グルタミン酸ジエチルエステル、D-グルタミン酸、4-フルオログルタミン酸が挙げられ、特に4-フルオログルタミン酸アナログが使用できる。」と記載されており、本件明細書の記載及び出願時の技術常識を考慮すれば、「L-グルタミン酸アナログ」に包含される具体的な物質を理解することができるから、本件訂正発明7は、明確に記載されているといえる。

(3)本件訂正発明8の記載について
請求人は、本件訂正発明8の記載について、「コリネ型細菌」に関する発明と「DNA」に関する発明という異なる2つの発明が併記されており、また、「さらに(i)のsym遺伝子が不活性化するように改変された」と記載されているが、訂正後の請求項1の(i)の変異型yggBタンパク質との関係が不明であるから、本件訂正発明8は、明確に記載されているとはいえない、と主張している。
しかしながら、本件訂正発明8は、「コリネ型細菌」に係る発明であることは明らかであり、また、本件訂正発明8の「(i)のsymA遺伝子」は、訂正後の請求項1の(i)ではなく、訂正後の請求項8の「(i)配列番号86の塩基番号585?1121の塩基配列を含むDNA。」を示すものであることは明らかであるから、本件訂正発明8は、明確に記載されているといえる。

(4)本件訂正発明9の記載について
請求人は、本件訂正発明9の記載について、「α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された」と記載されているが、比較の対象が特定されておらず、何に比べてα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が「低下」するのか不明であるから、本件訂正発明9は、明確に記載されているとはいえない、と主張している。
しかしながら、本件明細書の段落【0083】には、「α‐ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性」について、「「α‐ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下する」とは、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して低下していることをいう。」と記載されており、本件明細書の記載及び出願時の技術常識を考慮すれば、「α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下する」という記載の意味内容を理解することができるから、本件訂正発明9は、明確に記載されているといえる。

(5)本件訂正発明10、11の記載について
本件訂正発明10、11は、訂正後の請求項6?9を引用するものであるが、上記(1)?(4)で述べたように、本件訂正発明6?9は、明確に記載されているといえる以上、本件訂正発明10、11も、明確に記載されているといえる。

(6)本件訂正発明6の訂正後の請求項4、5を引用する部分の記載について
請求人は、本件訂正発明6の訂正後の請求項4、5を引用する部分の記載について、本件訂正発明4は、「前記変異型yggB遺伝子の変異は、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、100位のアラニンをスレオニンに、及び/または111位のアラニンをスレオニンもしくはバリンに置換する変異である、コリネ型細菌」に係る発明であるが、本件訂正発明6の(e)?(j)以外の変異型yggB遺伝子との関係が不明であり、また、本件訂正発明5は、「前記変異型yggB遺伝子の変異は、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、14位のロイシンと15位のトリプトファンの間に1?5アミノ酸を挿入する変異である、コリネ型細菌」に係る発明であるが、本件訂正発明6の(c)?(d)以外の変異型yggB遺伝子との関係が不明であるから、本件訂正発明6及び訂正後の請求項6を引用する本件訂正発明7?11は、明確に記載されているとはいえないと、平成30年5月22日付け口頭審理陳述要領書(第8頁下から第4行?第9頁最終行)で新たに主張している。
しかしながら、本件明細書の記載及び出願時の技術常識を考慮すれば、本件訂正発明6の訂正後の請求項4を引用する部分については、(e)?(j)の変異型yggB遺伝子が対応し、また、本件訂正発明6の訂正後の請求項5を引用する部分については、(c)?(d)の変異型yggB遺伝子が対応することは明らかであるから、本件訂正発明6及び訂正後の請求項6を引用する本件訂正発明7?11は、明確に記載されているといえる。

(7)まとめ
したがって、本件訂正発明6?12は、明確に記載されているといえるから、本件特許請求の範囲の記載は、特許法第36条第6項第2号に規定する要件を満たしていない、とすることはできない。

4.本件特許の請求項3に係る発明についての審判請求
本件特許の請求項3は、上記第2のとおり、本件訂正により削除された。その結果、本件特許の請求項3に係る発明についての審判請求は、その対象を欠くこととなったので、不適法な請求であり、その補正をすることができないものであるから、特許法第135条の規定により却下すべきものである。

第8 むすび
以上のとおりであるから、請求人の主張する理由及び提出した証拠方法によっては、本件訂正発明1?2及び4?12の特許を無効とすることはできない。
また、本件特許の請求項3に係る発明は、本件訂正により削除されたため、それらに対して請求人がした審判の請求については却下する。
審判に関する費用については、特許法第169条第2項の規定で準用する民事訴訟法第61条の規定により、参加によって生じた費用を含めて請求人及びその参加人が負担すべきものとする。
よって、結論のとおり審決する。
 
別掲
 
発明の名称 (54)【発明の名称】
L-グルタミン酸生産菌及びL-グルタミン酸の製造方法
【技術分野】
【0001】
本発明は、発酵工業に関し、詳しくは、L-グルタミン酸の製造法及びそれに用いる細菌に関する。L-グルタミン酸は調味料原料等として広く用いられる。
【背景技術】
【0002】
従来、L-グルタミン酸は、L-グルタミン酸生産能を有するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されている。これらのコリネ型細菌は、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。
【0003】
コリネ型細菌の野生株は、一般的にビオチンが存在している条件ではグルタミン酸を生成しない。したがって、コリネ型細菌によるグルタミン酸生産は、ビオチン制限、界面活性剤添加、ペニシリン添加等によってグルタミン酸生成を誘導した状態で行われる(非特許文献1)。また、これらの方法を適用しなくてもビオチンが十分存在している条件でL-グルタミン酸を生成できる株として、界面活性剤温度感受性株(特許文献1)、ペニシリン感受性株(特許文献2)、セルレニン感受性株(特許文献3)リゾチーム感受性株(特許文献4)等が開発されている。
【0004】
しかし、これらの手法により開発されたL-グルタミン酸生産菌は、脂肪酸合成能の低下や細胞壁合成能の低下を伴っている場合が多く、L-グルタミン酸生産と引き換えに環境変化への適応力の低下を引き起こしている可能性が高い。したがって、これらの手法を用いてL-グルタミン酸を著量蓄積できる菌株を開発するには相当の労力を要していた。
【0005】
一方、ビオチン十分条件でL-グルタミン酸を生成する株は、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を欠損させることによっても達成される(特許文献5)。しかし、TCAサイクルを途中で遮断するα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損株は生育が遅いことから菌体量の確保が困難などの課題があった。
【0006】
コリネ型細菌のyggB遺伝子は、エシェリヒア・コリのyggB遺伝子のホモログであり(非特許文献2,3)、メカノセンシティブチャンネル(mechanosensitive channel)の一種として解析されているが、(非特許文献4)、L-グルタミン酸に及ぼす影響については知られていなかった。
【特許文献1】国際公開99/02692号パンフレット
【特許文献2】特開平04-088994号公報
【特許文献3】特開昭55-124492号公報
【特許文献4】国際公開00/14241号パンフレット
【特許文献5】国際公開95/34672号パンフレット
【非特許文献1】Biosci.Biotech.Biochem.,61(7),1109-1112,1997
【非特許文献2】FEMS Microbiol Lett.2003 Jan 28;218(2):305-9.
【非特許文献3】Mol Microbiol.2004 Oct;54(2):420-38.
【非特許文献4】EMBO J.1999,18(7):1730-7
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、コリネ型細菌を用いたL-グルタミン酸の製造において、L-グルタミン酸生産能力を向上させる新規な技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本研究者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、yggB遺伝子がコリネ型細菌のL-グルタミン生産に関与していることを明らかにし、yggB遺伝子を用いてコリネ型細菌を改変することにより、L-グルタミン酸の生産能が大幅に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち本発明は、以下の通りである。
(1)L-グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、yggB遺伝子を用いて改変されたことにより、非改変株と比較してL-グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌。
(2)前記yggB遺伝子が、以下の(a)?(h)のいずれかから選択されるDNAである(1)のコリネ型細菌:
(a)配列番号5の塩基番号1437?3035の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号5の塩基番号1437?3035の相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、コリネ型細菌に導入することにより、該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(c)配列番号61の塩基番号507?2093の塩基配列を含むDNA、
(d)配列番号61の塩基番号507?2093の相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、コリネ型細菌に導入することにより、該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(e)配列番号67の塩基番号403?2001の塩基配列を含むDNA、
(f)配列番号67の塩基番号403?2001の相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、コリネ型細菌に導入することにより、該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(g)配列番号83の塩基番号501?2099の塩基配列を含むDNA、
(h)配列番号83の塩基番号501?2099の相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、コリネ型細菌に導入することにより、該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(3)前記yggB遺伝子が、配列番号6、62、68、84、もしくは85ら選択されるアミノ酸配列、または配列番号6、62、68、84、もしくは85から選択されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNAである(1)のコリネ型細菌。
(4)yggB遺伝子の発現量が非改変株と比較して上昇するように改変された、(1)のコリネ型細菌。
(5)yggB遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、該遺伝子の発現量が上昇するように改変された、(4)のコリネ型細菌。
(6)変異型yggB遺伝子が導入された、(1)のコリネ型細菌。
(7)前記変異型yggB遺伝子が、配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸番号419-533の配列、または配列番号62のアミノ酸番号419-529の配列をコードする領域に変異を有する、(6)のコリネ型細菌。
(8)前記変異は、前記領域の欠失である、(7)のコリネ型細菌。
(9)前記変異は、前記領域へのインサーションシーケンス又はトランスポゾンの挿入である、(7)のコリネ型細菌。
(10)前記変異は、前記領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異である(7)のコリネ型細菌。
(11)前記変異型yggB遺伝子が、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、424位及び/または437位のプロリンを他のアミノ酸に置換する変異である、(7)のコリネ型細菌。
(12)前記変異型yggB遺伝子が、yggB遺伝子がコードするタンパク質の膜貫通領域に変異を有する遺伝子である、(6)のコリネ型細菌。
(13)前記膜貫通領域が、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、アミノ酸番号1-23、25-47、62-84、86-108、及び110-132からなる群から選ばれる領域である、(12)のコリネ型細菌。
(14)前記変異が、フレームシフトを伴うことなく導入された、(12)のコリネ型細菌。
(15)前記変異型yggB遺伝子が、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、100位のアラニン及び/または111位のアラニンを他のアミノ酸に置換する変異を有する遺伝子である、(12)のコリネ型細菌。
(16)前記変異型yggB遺伝子が、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、14位のロイシンと15位のトリプトファンの間に1又は数アミノ酸を挿入する変異を有する遺伝子である、(12)のコリネ型細菌。
(17)前記変異型yggB遺伝子の導入により、L-グルタミン酸アナログ耐性が向上したことを特徴とする、(6)?(16)のいずれかのコリネ型細菌。
(18)さらに上記変異型yggB遺伝子の機能を抑制する遺伝子が不活化するように改変された、(6)?(17)のいずれかのコリネ型細菌。
(19)前記変異型yggB遺伝子の機能を抑制する遺伝子がsymA遺伝子であり、前記symA遺伝子が以下の(i)または(j)から選択されるDNAである(18)のコリネ型細菌:
(i)配列番号86の塩基番号585?1121の塩基配列を含むDNA、
(j)配列番号86の塩基番号585?1121の相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、コリネ型細菌内で変異型yggB遺伝子の機能を抑制するDNA。
(20)さらにα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された、(1)?(19)のいずれかのコリネ型細菌。
(21)コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する、(1)?(20)のいずれかのコリネ型細菌。
(22)(1)?(21)のいずれかのコリネ型細菌を培地で培養し、L-グルタミン酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体からL-グルタミン酸を回収することを特徴とするL-グルタミン酸の製造法。
(23)下記(a)?(p)より選ばれる変異型yggB遺伝子:
(a)配列番号8のアミノ酸配列をコードするDNA、
(b)配列番号8のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(c)配列番号20のアミノ酸配列をコードするDNA、
(d)配列番号20のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(e)配列番号22のアミノ酸配列をコードするDNA、
(f)配列番号22のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(g)配列番号24のアミノ酸配列をコードするDNA、
(h)配列番号24のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(i)配列番号64のアミノ酸配列をコードするDNA、
(j)配列番号64のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(k)配列番号70のアミノ酸配列をコードするDNA、
(l)配列番号70のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(m)配列番号74のアミノ酸配列をコードするDNA、
(n)配列番号74のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(24)変異型yggB遺伝子を保有するコリネ型細菌の製造方法であって、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を欠損させたコリネ型細菌を、ビオチンを過剰量含む培地に接種し、同培地でL-グルタミン酸を蓄積可能とする株を取得することを特徴とする方法。
(25)変異型yggB遺伝子を保有するコリネ型細菌の製造方法であって、in vitroでランダムに変異を導入したyggB遺伝子を導入したコリネ型細菌を、ビオチンを過剰量含む培地に接種し、同培地でL-グルタミン酸を蓄積可能とする株を取得することを特徴とする方法。
(26)変異型yggB遺伝子を保有するコリネ型細菌の製造方法であって、転移因子を染色体上にランダムに導入したコリネ型細菌を、ビオチンを過剰量含む培地に接種し、同培地でL-グルタミン酸を蓄積可能とする株を取得することを特徴とする方法。
(27)変異型yggB遺伝子を保有するコリネ型細菌の製造方法であって、コリネ型細菌をL-グルタミン酸アナログを含む培地で培養し、同培地で生育可能な株を取得することを特徴とする方法。
(28)前記変異型yggB遺伝子を保有する菌株が(6)?(16)のいずれかのコリネ型細菌である、(24)?(27)のいずれかのコリネ型細菌の製造方法。
(29)前記ビオチンを過剰量含む培地が、ビオチンを30μg/L以上含有する培地である、(24)?(28)のいずれかのコリネ型細菌の製造方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明のyggB遺伝子を用いて改変したコリネ型細菌を用いることにより、L-グルタミン酸を効率よく生産することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【0011】
以下、本発明を詳細に説明する。
<1>本発明のコリネ型細菌
本発明のコリネ型細菌は、L-グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、yggB遺伝子を用いて改変されたことにより、非改変株と比較してL-グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌である。
【0012】
本発明において、「コリネ型細菌」とは、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に分類された細菌も含み(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1991))、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(コリネバクテリウム・エフィシエンス)
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【0013】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカムATCC15806
コリネバクテリウム・アルカノリティカムATCC21511
コリネバクテリウム・カルナエATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13020,ATCC13032,ATCC13060
コリネバクテリウム・リリウムATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラATCC17965
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスAJ12340(FERM BP-1539)
コリネバクテリウム・ハーキュリスATCC13868
ブレビバクテリウム・ディバリカタムATCC14020
ブレビバクテリウム・フラバムATCC13826,ATCC14067(コリネバクテリウム・グルタミカムATCC14067)
ブレビバクテリウム・フラバムATCC13826,ATCC14067
ブレビバクテリウム・インマリオフィラムATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869(コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13869)
ブレビバクテリウム・ロゼウムATCC13825
ブレビバクテリウム・サッカロリティカムATCC14066
ブレビバクテリウム・チオゲニタリスATCC19240
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC6871、ATCC6872
ブレビバクテリウム・アルバムATCC15111
ブレビバクテリウム・セリヌムATCC15112
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラムATCC15354
【0014】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受けることができる。すなわち、各菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、AJ12340株は、1987年10月27日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所(現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託センター)(〒305-5466 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)にFERM BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。
【0015】
本発明において、「L-グルタミン酸生産能」とは、本発明のコリネ型細菌を培養したときに、培地中または菌体内にL-グルタミン酸を蓄積する能力をいう。コリネ型細菌の多くは後述する「L-グルタミン酸生産条件」でL-グルタミン酸を生産することができるため、「L-グルタミン酸生産能」は、コリネ型細菌の野生株の性質として有するものであってもよい。ただし、育種によって付与または増強された性質であってもよく、さらに後述するようにして、yggB遺伝子を用いた改変によって、L-グルタミン酸の生産能が付与されたものでもよい。
「L-グルタミン酸生産能が向上した」とは、野生株などの非改変株と比較して、L-グルタミン酸生産能が上昇したことを意味する。ここで、コリネ型細菌の野生株としては、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株、13869株、14067株、コリネバクテリウム・メラセコーラATCC17965株などが挙げられる。なお、「非改変株」としては、上記のような野生株と同程度のyggB遺伝子の発現量を示すような株、yggB遺伝子のコード領域内に変異が導入されていない株も含む。
【0016】
育種によってL-グルタミン酸生産能を付与または増強するための方法としては、例えば、L-グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変する方法を挙げることができる。L-グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセルムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオ-スリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼなどが挙げられる。
【0017】
これらの遺伝子の発現の増強は、後述のyggB遺伝子の発現増強と同様にして行うことができる。
【0018】
クエン酸シンターゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、及び/又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された微生物としては、国際公開00/18935号パンフレット、特開2000-232890号公報等に記載された微生物が例示できる。
【0019】
L-グルタミン酸生産能を付与するための改変は、L-グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることにより行ってもよい。L-グルタミン酸の生合成経路から分岐してL-グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、イソクエン酸リアーゼ、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼなどが挙げられるが、この中でも特にα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した株が望ましい。例えば、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した株として、以下の菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株(国際公開95/34672号パンフレット)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821(FERM BP-4172;フランス特許公報9401748号明細書参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12822(FERM BP-4173;フランス特許公報9401748号明細書参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12823(FERM BP-4174;フランス特許公報9401748号明細書参照)
【0020】
上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、染色体上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。例えば、遺伝子組換えによって、染色体上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ(SD)配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、染色体上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換(ミスセンス変異)を導入すること、また終始コドンを導入すること(ナンセンス変異)、1?2塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る。(Journal of biological Chemistry 272:8611-8617(1997))また、コード領域が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子で染色体上の正常遺伝子を置換すること、トランスポゾン、IS(インサーションシークエンス)因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
【0021】
例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むDNAでコリネ型細菌を形質転換し、変異型遺伝子と染色体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は既に確立しており、直鎖上DNAを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある(米国特許第6303383号、又は特開平05-007491号公報)。コリネ型細菌の温度感受性プラスミドとしては、p48K及びpSFKT2(以上、米国特許第6303383号参照)、pHSC4(フランス特許公開1992年2667875号公報、特開平5-7491号公報参照)等が挙げられる。これらのプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくとも25℃では自律複製することができるが、37℃では自律複製できない。pHSC4を保持するエシェリヒア・コリAJ12571は、1990年10月11日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所(現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託センター)(〒305-5466 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に受託番号FERM P-11763として寄託され、1991年8月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-3524の受託番号で寄託されている。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換により部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。コリネ型細菌内で複製能を持たないプラスミドは、エシェリヒア・コリで複製能力を持つプラスミドが好ましく、例えば、pHSG299(宝バイオ社製)pHSG399(宝バイオ社製)等が挙げられる。
【0022】
変異型の目的遺伝子を宿主染色体上の目的遺伝子と置換するには、例えば以下のようにすればよい。まず、温度感受性複製起点、変異型目的遺伝子、レバンシュークラーゼをコードするsacB遺伝子及びクロラムフェニコール等の薬剤耐性を示すマーカー遺伝子を挿入して組換え用プラスミドを調製する。
【0023】
ここで、レバンシュークラーゼをコードするsacB遺伝子は、染色体上からベクター部分が脱落した菌株を効率よく選択する為に使用される遺伝子である(Schafer,A.et al.Gene145(1994)69-73)。すなわち、コリネ型細菌では、レバンシュークラーゼを発現させると、シュークロースを資化することによって生成したレバンが致死的に働き、生育することが出来ない。従って、レバンシュークラーゼを搭載したベクターが染色体上に残ったままの菌株をシュークロース含有プレートで培養すると生育できず、ベクターが脱落した菌株のみシュークロース含有プレートで選択することが出来る。
【0024】
sacB遺伝子又はその相同遺伝子は、以下のような配列の遺伝子を用いることが出来る。
バチルス・ズブチルス:sacB GenBank Accession Number X02730 (配列番号11)
バチルス・アミロリキュファシエンス:sacB GenBank Accession Number X52988
ザイモモナス・モビリス:sacB GenBank Accession Number L33402
バチルス・ステアロサーモフィラス:surB GenBank Accession Number U34874
ラクトバチルス・サンフランシセンシス:frfA GenBank Accession Number AJ508391
アセトバクター・キシリナス:lsxA GenBank Accession Number AB034152
グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス:lsdA GenBank Accession Number L41732
【0025】
上記のようにして得られる形質転換体を温度感受性複製起点が機能する温度(25℃)で培養し、プラスミドを導入した株を取得する。プラスミド導入株を温度感受性複製起点が機能しない高温(例えば34℃)で培養し、温度感受性プラスミドを脱落させ、抗生物質を含有するプレートに本菌株を塗布する。温度感受性プラスミドは高温で複製できないので、プラスミドが脱落した菌株は、抗生物質を含有したプレートでは生育出来ないが、プラスミド上の変異型遺伝子と染色体上の目的遺伝子と組換えを起こした菌株が出現する。
【0026】
こうして染色体に組換えDNAが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在する目的遺伝子配列との組換えを起こし、染色体の目的遺伝子と欠失型の目的遺伝子との融合遺伝子2個が組換えDNAの他の部分(ベクター部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカー)を挟んだ状態で染色体に挿入されている。
【0027】
次に、染色体DNA上に欠失型の目的遺伝子のみを残すために、目的遺伝子領域をベクター部分(温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカーを含む)とともに染色体DNAから脱落させる。その際、正常な目的遺伝子が染色体DNA上に残され、欠失型目的遺伝子が切り出される場合と、反対に欠失型目的遺伝子が染色体DNA上に残され、正常な目的遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養すれば、切り出されたDNAはプラスミド状で細胞内に保持される。次に、温度感受性複製起点が機能しない温度(高温)で培養すると、プラスミド上の目的遺伝子は、プラスミドとともに細胞から脱落する。sacBを搭載したプラスミドを用いている場合には、この時に培地にスクロースを添加することにより、プラスミドが細胞から脱落した株を効率的に選択できる。プラスミドを脱落した株より目的遺伝子に変異が残った株を選択することによって、目的遺伝子が欠失型に置換された株を取得することができる。
【0028】
L-グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸に耐性を付与する方法(特開昭50-113209)、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法(特開昭57-065198)、ウレアーゼを弱化させる方法(特開昭52-038088)、マロン酸に耐性を付与する方法(特開昭52-038088)、ベンゾピロンまたはナフトキノン類に耐性を付与する方法(特開昭56-1889)、HOQNO耐性を付与する方法(特開昭56-140895)、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法(特開昭57-2689)、グアニジン耐性を付与する方法(特開昭56-35981)、ペニシリンに対する感受性を付与する方法(特開平4-88994)などが挙げられる。
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949(BP-2632:特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628(P-5736;特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-5007;特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM P-P-5020;特開昭56-1889号公報参照)ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-4318;特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM-P4319;特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-5472;特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-5136;特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM BP-3004;特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426(FERM P-5123;特開平56-048890号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440(FERM P-5137;特開平56-048890号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796(FERM P-6402;特開平58-158192号公報参照)
【0029】
本発明のコリネ型細菌は、上記のようなL-グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌を、yggB遺伝子を用いてL-グルタミン酸生産能がさらに向上するように改変することによって得ることができる。あるいは、yggB遺伝子を用いて改変した後に、さらに、上述したようなL-グルタミン酸生産能を付与または向上させる操作を付加的に行ってもよい。
yggB遺伝子を用いた改変としては、後述のようなyggB遺伝子の発現量を増加させること、および変異型yggB遺伝子を導入することを含む。
【0030】
(I)yggB遺伝子の発現量の増強
yggB遺伝子は、メカノセンシティブチャンネル(mechanosensitive channel)の一種として知られ、mscSとも呼ばれるタンパク質をコードする(FEMS Microbiol Lett.2003 Jan 28;218(2):305-9.)。
yggB遺伝子の発現量を増加させることにより、コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能が非改変株に比べて向上する。すなわち、yggB遺伝子の発現量が増加するように改変されたコリネ型細菌を培養することにより、非改変株に比べて多くの量のL-グルタミン酸を培地中に蓄積するか、あるいは、非改変株に比べて速い速度でL-グルタミン酸を生産する。例えば、yggB遺伝子発現増強株は、親株あるいは非改変株と比べて、対糖収率でL-グルタミン酸の収率が2%以上上昇していることが好ましく、4%以上上昇していることがより好ましく、6%以上向上していることが特に好ましい。yggB遺伝子発現増強株は、非改変株と比べて、除菌体収率が向上していてもよい。除菌体収率とは、対糖収率から菌体生成に用いられた炭素収率を除いたものを意味する。
【0031】
yggB遺伝子の発現量が上昇したことの確認は、yggBのm-RNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001))。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。
【0032】
yggB遺伝子の発現量が上昇するように改変されたコリネ型細菌は、L-グルタミン酸生産条件と過剰量のビオチンを含む条件の少なくとも1つの条件で、非改変株と比べてL-グルタミン酸生産能が向上していればよい。
ここで、「L-グルタミン酸生産条件」とは炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する培地に、L-グルタミン酸生産を誘導する物質を添加したり、あるいはL-グルタミン酸生産を阻害する物質の培地中の量を制限した条件を意味し、L-グルタミン酸生産を誘導するために添加する物質には、ペニシリンGやTween40等の飽和脂肪酸を含む界面活性剤が挙げられ、L-グルタミン生産を阻害するために制限する物質とはビオチンが挙げられる(アミノ酸発酵 学会出版センター 1986年)。L-グルタミン酸生産条件でのこれらの物質の培地中の添加濃度は、ビオチンは、15μg/L未満、好ましくは、10μg/L未満、さらに好ましくは、5μg/L未満であり、培地中にビオチンを全く含まなくてもよい。ペニシリンの培地中の添加濃度は、0.1U/ml以上、好ましくは、0.2U/ml以上、さらに好ましくは、0.4U/ml以上であり、界面活性剤の添加濃度は、0.5g/L以上、好ましくは、1g/L以上、さらに好ましくは、2g/L以上である。
一方、「過剰量のビオチンを含む条件」とは、例えば、培地中にビオチンを30μg/L以上、好ましくは40μg/L、さらに好ましくは50μg/L含む条件をいう。
【0033】
コリネ型細菌のyggB遺伝子としては、例えば、配列番号6、62、68、または84のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、配列番号5の塩基配列1437-3035番目の配列を有する遺伝子、配列番号61の塩基配列507-2093番目の配列を有する遺伝子、配列番号67の塩基配列403-2001番目の配列を有する遺伝子、配列番号83の塩基配列501-2099番目の配列を有する遺伝子などが挙げられる。配列番号5の塩基配列1437-3035番目の配列を有する遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869株のyggB遺伝子であり、配列番号61の塩基配列507-2093番目の配列を有する遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカム(ブレビバクテリウム・フラバム)ATCC14967株のyggB遺伝子であり、配列番号67の塩基配列403-2001番目の配列を有する遺伝子は、コリネバクテリウム・メラセコーラATCC17965株のyggB遺伝子である。配列番号83の塩基配列501-2099番目の配列を有する遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のGenbank Accession No.NC_003450として登録されているゲノム配列中の塩基番号1336092-1337693にコードされており、NCgl 1221として登録されている(NP_600492.Reports small-conductance...[gi:19552490])。
また、コリネ型細菌の種や菌株によってyggB遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、yggB遺伝子は配列番号5の塩基番号1437-3035番目からなる塩基配列のバリアントであってもよい。yggB遺伝子のバリアントは、配列番号5の塩基番号1437-3035番目からなる塩基配列の配列を参考にして、BLAST等によって検索出来る(http://blast.genome.jp/)。また、yggB遺伝子のバリアントは、yggB遺伝子ホモログ、例えばコリネ型細菌の染色体を鋳型にして例えば配列番号75、76の合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRで増幅可能な遺伝子を含む。また、本発明の遺伝子は、コリネ型細菌のyggB遺伝子が望ましいがコリネ型細菌で機能を有する限り、他の微生物由来の遺伝子を用いてもよい。また、後述する変異型yggB遺伝子を用いてもよい。
【0034】
yggB遺伝子は、コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるものである限り、配列番号6、62、68または84に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで、数個とは、例えば、2?20個、好ましくは2?10個、より好ましくは2?5個を意味する。
上記置換は保存的置換が好ましく、保存的置換としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrから ser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。
さらに、本発明のyggB遺伝子は、配列番号6、62、68、または84のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させる遺伝子も含む。ここで、ホモロジーは、KarlinとAltschulによるBLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))やPearsonによるFASTA(Methods Enzymol.,183,63(1990))などによって計算することができる。これらのアルゴリズムによるホモロジー検索プログラム(BLASTN、BLASTPなど)が、NCBIなどより入手できる(//www.ncbi.nlm.nih.gov)。
なお、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、yggB遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。
【0035】
特に配列番号6の以下の位置のアミノ酸は置換・欠失していてもよい。コリネ型細菌に保存されるYggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号85に示し、アミノ酸置換・欠失が起こっていてもよい箇所をXaaで示す。
48番目のグルタミン残基(望ましくはアルギニン残基への置換)
275番目のアスパラギン残基(望ましくはセリン残基への置換)
298番目のグルタミン酸残基(望ましくはアラニン残基への置換)
343番目のアラニン残基(望ましくはバリン残基への置換)
396番目のフェニルアラニン残基(望ましくはイソロイシン残基への置換)
438番目のセリン残基(望ましくはグリシン残基への置換)
445番目のバリン残基(望ましくはアラニン残基への置換)
454番目のアラニン残基(望ましくはバリン残基への置換)
457番目のプロリン残基(望ましくはセリン残基への置換)
474番目のセリン残基(望ましくはアスパラギン残基への置換)
517番目のバリン残基(望ましくは欠失)
518番目のグルタミン酸残基(望ましくは欠失)
519番目のアラニン残基(望ましくは欠失)
520番目のプロリン残基(望ましくは欠失)
【0036】
上記のようなyggB遺伝子ホモログは、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号5の塩基配列の1437-3035番目の配列を有する遺伝子、配列番号61の塩基配列の507-2093番目の配列を有する遺伝子、配列番号67の塩基配列の403-2001番目の配列を有する遺伝子、または配列番号83の塩基配列の501-2099番目の配列を有する遺伝子を改変することによって取得することができる。
また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、配列番号5の塩基配列の1437-3035番目の配列を有する遺伝子、配列番号61の塩基配列の507-2093番目の配列を有する遺伝子、配列番号67の塩基配列の403-2001番目の配列を有する遺伝子、または配列番号83の塩基配列の501-2099番目の配列を有する遺伝子を有する遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート(EMS)等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、yggB遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。これらの遺伝子がコリネ型細菌に導入したときにL-グルタミン酸生産能を向上させるか否かは、例えば、これらの遺伝子をコリネ型細菌の野生株に導入し、上述の条件でL-グルタミン酸の生産能が向上するかどうかを調べることにより、確かめることができる。
【0037】
またyggB遺伝子は、配列番号5の1437-3035番目の配列、配列番号61の507-2093番目の配列、配列番号67の403-2001番目の配列、または配列番号83の501-2099番目の配列の相補配列又はこれらの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコリネ型細菌に導入したときにL-グルタミン酸生産能を向上させるDNAが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件で、1回より好ましくは2?3回洗浄する条件が挙げられる。
【0038】
プローブとして、配列番号5の塩基番号1437-3035の塩基配列の相補配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、配列番号5の塩基番号1437-3035の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号5の塩基番号1437-3035の塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1%SDSが挙げられる。またプローブの作成には配列番号75、76の配列が用いられる。
なお、発現量を増強するyggB遺伝子は、後述するような変異型yggB遺伝子であってもよい。
【0039】
yggB遺伝子の発現を増強するための方法としては、yggB遺伝子のコピー数を増加させる方法や、yggB遺伝子の発現調節領域を改変する方法や、yggB遺伝子の転写活性因子を増幅する方法や、yggB遺伝子の転写抑制因子の活性を低下する方法などが挙げられる。
【0040】
以下、L-グルタミン酸生産能を有し、yggB遺伝子の発現量が上昇するように改変されたコリネ型細菌の構築方法を示す。これらの方法は、Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001)等のマニュアルに従って実施出来る。
【0041】
同遺伝子の発現量の増強は、yggB遺伝子のコピー数を高めることによって達成でき、コピー数を高めることは、以下のようにプラスミドでyggB遺伝子を増幅することによって達成出来る。まずyggB遺伝子は、コリネ型細菌の染色体からクローニングする。染色体DNAは、DNA供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法(H.Saito and K.Miura,Biochem.B iophys.Acta,72,619(1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、97?98頁、培風館、1992年参照)等により調製することができる。PCRに用いるオリゴヌクレオチドは上記の公知情報に基づいて合成でき、例えば配列番号75、76に記載の合成オリゴヌクレオチドを用いyggB遺伝子を増幅することが出来る。
【0042】
PCR法により増幅されたyggB遺伝子を含む遺伝子断片は、エシェリヒア・コリ及び/またはコリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299,pHSG399,pHSG398,RSF1010,pBR322,pACYC184,pMW219等が挙げられる。
【0043】
上記DNAをコリネ型細菌で機能するベクターに導入する。コリネ型細菌で機能するベクターとは、例えばコリネ型細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的に例示すれば、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドとしては、例えば、特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30;特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX;特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3;特開昭58-67679号公報に記載のpAM330;特開昭58-77895号公報に記載のpHM1519;特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844;特開昭57-134500号公報に記載のpCG1;特開昭58-35197号公報に記載のpCG2;特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11等、特開平10-215883号公報に記載のpVK7を挙げることができる。
【0044】
また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つDNA断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。
【0045】
yggB遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクターを連結して組換えDNAを調製するには、yggB遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。この制限酵素サイトはあらかじめyggBの増幅に用いる合成オリゴヌクレオチドに導入されていてもよい。連結はT4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
【0046】
上記のように調製した組換えプラスミドをコリネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法(Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970))があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法(Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E.,Gene,1,153(1977))がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法(Chang,S.andChoen,S.N.,Mol.Gen.Genet.,168,111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.andHopwood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
75 1929(1978))も応用できる。また、電気パルス法(特開平2-207791号公報)や、接合伝達法(Biotechnology(NY).1991 Jan;9(1):84-7).によっても、コリネ型細菌の形質転換を行うことができる。
【0047】
yggB遺伝子のコピー数を高めることは、yggB遺伝子をコリネ型細菌の染色体DNA上に複数コピー存在させることによっても達成できる。コリネ型細菌の染色体DNA上にyggB遺伝子を複数コピー導入するには、染色体DNA上に複数コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、yggB遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。(特開平2-109985号、特開平7-107976号、Mol.Gen.Genet.,245,397-405(1994)、Plasmid.2000 Nov;44(3):285-91)。トランスポゾンでの増幅は後述に示される人工トランスポゾンでの増幅も利用できる。
【0048】
また、宿主で複製できない複製起点あるいは、宿主で複製出来ない複製起点と宿主への接合伝達能を有するプラスミドにyggB遺伝子を導入して、染色体上で増幅させる方法が考えられる。例えば用いることが出来るベクターは、pSUP301(Simo等,Bio/Technology 1,784?791(1983))、pK18mobまたはpK19mob(Schaefer等,Gene 145,69?73(1994))、pGEM-T(Promega corporation,Madison,WI,USA)、pCR2.1-TOPO(Shuman(1994).Journal of Biological Chemisty 269:32678?84;US-A 5487993)、pCR(R)Blunt(Invitrogen,Groningen,Netherlands;Bernard et al.,Journal of Molecular Biology,234:534?541(1993))、pEM1(Schrumpf等,1991,Journal of Bacteriology 173:4510?4516)またはpBGS8(spratt等,1986,Gene,41:337?342)等が挙げられる。yggB遺伝子を含むプラスミドベクターをコリネ型細菌中に接合または形質転換によって転移させる。接合法は、例えばSchaefer等(Applied and Environmental Microbiology 60,756?759(1994))に記載されている。形質転換法は、例えばTheirbach等(Applied Microbiology and Biotechnology 29,356?362(1988))、DunicanおよびShivinan(Bio/Technology 7,1067?1070(1989))およびTauch等(FEMS Microbiological Letters 123,343?347(1994))に記載されている。
【0049】
また、yggB遺伝子の発現を上昇させる手段として染色体DNA上またはプラスミド上のyggB遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換すること、yggB遺伝子の発現調節に関与する因子、例えばオペレーターやリプレッサーを改変すること、遺伝子の終止コドンの下流に強力なターミネーターを連結することによっても達成される。(Hamilton et al,;Journal of Bacterology171:4617-4622)例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、PS2プロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1995,1,105-128)等に記載されている。また、国際公開WO00/18935に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、よりコンセンサスに近づける配列に置換し、強力なものに改変することも可能である。例えば、-35領域をTTGACA、TTGCCA配列に、-10領域をTATAAT、TATAAC配列に置換することが考えられる。さらに、リボソーム結合部位(RBS)と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。ここでyggB遺伝子の発現調節領域とは、yggB遺伝子の発現量に変化を及ぼす領域を意味し、例えばyggB遺伝子の上流領域が挙げられる。ここでyggB遺伝子上流の改変に適している領域として、開始コドン以前の領域(例えば、配列番号5の開始コドン以前(塩基配列番号1436以前))の領域、望ましくは開始コドンの上流500bpの領域、さらに望ましくは開始コドンの上流300bpの領域が挙げられる。
発現調節配列の置換は、例えば上述の温度感受性プラスミドを用いて行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、yggB遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【0050】
<II>変異型yggB遺伝子の導入
yggB遺伝子を用いた改変として、コリネ型細菌への変異型yggB遺伝子の導入も挙げられる。ここで、「変異型yggB遺伝子の導入」とは、コリネ型細菌の染色体上のyggB遺伝子への変異の導入であってもよいし、変異型yggB遺伝子を含むプラスミドのコリネ型細菌への導入であってもよいし、染色体上のyggB遺伝子の変異型yggB遺伝子への置換であってもよい。
本発明において、「変異型yggB遺伝子」とは、yggB遺伝子のコード領域内の変異であって、コリネ型細菌のビオチンを過剰量含む条件下でのL-グルタミン酸生産能を向上させる機能をyggB遺伝子に付与する変異、を含むyggB遺伝子を意味する。なお、変異型yggB遺伝子は、コリネ型細菌に導入したときに、ビオチンを過剰量含む条件下だけでなく、上述したようなL-グルタミン酸生産条件でもL-グルタミン酸生産能を向上させる遺伝子であって
もよい。
「過剰量のビオチンを含む条件下でのL-グルタミン酸生産能が向上した」とは、本発明のコリネ型細菌を、非改変株がL-グルタミン酸を蓄積できないような濃度のビオチンを含む条件、例えば、30μg/L以上の濃度のビオチンを含む培地で培養したときに、本発明のコリネ型細菌が、非改変株に比べて多くの量のL-グルタミン酸を培地中に蓄積するか、あるいは、非改変株に比べて速い速度でL-グルタミン酸を生産することを意味する。
【0051】
以下、本発明の変異型yggB遺伝子の取得方法、yggB遺伝子に変異を導入する方法について記載する。しかしながら、変異型yggB遺伝子の取得方法、yggB遺伝子に変異を導入する方法は以下の方法には限定されない。
(II-1)odhA遺伝子欠損株を利用する方法
変異型yggB遺伝子を取得する方法として、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼのE1oサブユニットをコードしているodhA遺伝子(sucA遺伝子)を欠損した株(以下odhA破壊株という)が利用出来ることを本発明者は発見した。odhA破壊株の構築は、上述したようなsacB遺伝子などを用いる方法によって行うことが可能である。
【0052】
本発明において、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ(α-KDGH)活性とは、α-ケトグルタル酸(2-オキソグルタル酸)を酸化的に脱炭酸し、サクシニル-CoA(succinyl-CoA)を生成する反応を触媒する活性を意味する。上記反応は、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ(E1o EC1.2.4.2)、ジヒドロリポアミドS-サクシニルトランスフェラーゼ(E2o dihydrolipoamide-S-succinyltransferase)、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ(E3 dihydrolipoamide dehydrogenase)の3種の酵素によって触媒され、エシェリヒア・コリ等では、この3種の酵素が複合体を形成している。α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼは、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ(oxoglutarate dehydrogenase(succinyl-transferase))、2-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ(2-oxoglutarate dehydrogenase)とも呼ばれる。α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性は、Shiioらの方法(Isamu Shiio and Kyoko Ujigawa-Takeda,Agric.Biol.Chem.,44(8),1897-1904,1980)に従って測定することができる。
【0053】
コリネ型細菌のα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼのE1oサブユニットをコードしているodhA遺伝子の配列は既に明らかにされている(Microbiology 142,3347-3354,(1996)、GenBank accession No.D84102)。odhA遺伝子の塩基配列を配列番号43の塩基番号443?4213に、アミノ酸配列を配列番号44に示す。このodhA遺伝子の配列を基に、例えば、配列番号1、2に記載のようなodhA遺伝子に相補的なプライマーを設計し野生株であるATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、odhA遺伝子の内部配列のみを増幅する。odhA遺伝子の内部断片をプラスミドに連結し、odh破壊用プラスミドを構築する。ここで用いるプラスミドとしては、コリネ型細菌用の温度感受性プラスミドや(特開平05-007491)、実施例1に記載のレバンシュークラーゼを搭載するスイサイドベクターであるpBS3が用いられる。
【0054】
odh破壊用プラスミド電気パルス法(特開平2-207791)にて、培地中にビオチンが充分存在する条件でL-グルタミン酸を蓄積できない株、例えば野生株、C.glutamicum ATCC13869へに導入し、染色体上のodhA遺伝子と相同組換えを起こした1回組換え株を取得する。温度感受性プラスミドを用いた場合には、プラスミドが複製出来ない温度で1回組換え株を取得する。1回組換え株であることの確認は、例えば、配列番号3、配列番号4のオリゴヌクレオチドを用いて、プラスミドが染色体上に導入されることによって確認出来る。
【0055】
このようにして取得したodhA破壊株は、糖を含む培地で純化する。純化の過程でyggB遺伝子に高頻度に自然突然変異が導入される。純化した株のグルタミン酸生産能は、ビオチンが過剰量含まれる培地で培養することにより確認する。例えば20mlのL-グルタミン酸生産フラスコ培地(グルコース30g/l,硫酸アンモニウム15g/l,KH_(2)PO_(4) 1g/l,MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l,FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l,MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l,VB1(ビタミンB1) 200μg/l,Biotin 300μg/l,大豆加水分解物(T-N全窒素)0.48g/l,KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に候補株を接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養し、糖を完全消費後、L-グルタミン酸の蓄積を確認する。L-グルタミン酸の対糖収率が50%以上を示した株について、そのyggB遺伝子の配列を決定することにより変異を特定することができる。
【0056】
yggB変異のみを有する株を構築するためには、プラスミドによって破壊された染色体上のodhA遺伝子を野生型に復帰させればよい。odhAが欠損した株では糖を含まない培地での生育が著しく遅いが、odhAが野生型に復帰すれば、糖を含まない培地、例えばCM2B(ポリペプトン10g/l、酵母エキス10g/l、NaCl 5g/l、Biotin 10μg/L、寒天20g/l、KOHを用いてpH7.0に調整)のような培地でも良好に生育する。従って、このodhA破壊株をCM2Bプレートに塗布し、生育改善株を誘導する。こうして出現した生育改善株をCM2Bプレートで純化し、その抗生物質耐性感受性とベクター残存の有無を調べれば、odhA復帰株であることが推定できる。さらにodhA遺伝子の塩基配列を決定することにより、odhA遺伝子が野生型であることを確認する。
【0057】
また、odhA yggB二重変異株の変異型yggB遺伝子領域をPCRでクローニングし、野生株に導入してもよい。二重変異株の染色体DNAを鋳型として、配列番号9と配列番号10に示す合成DNAを用いてPCRを行い変異型yggB遺伝子を増幅する。得られた増幅産物をコリネ型細菌用の温度感受性プラスミドや(特開平05-007491)、実施例1に記載のスイサイドベクターであるpBS3にクローニングし、上述したようなsacB遺伝子などを用いる方法で野生型yggB遺伝子と置換することによりyggB単独変異株が構築可能である。ここで、染色体上のyggB遺伝子に変異が導入されたかどうかは、変異型yggB遺伝子の遺伝子配列を決定することにより確認することが出来る。
【0058】
(II-2)転移因子を利用する方法
また、変異型yggB遺伝子を有するコリネ型細菌はコリネ型細菌で機能する転移因子を用いてスクリーニングしてもよい。転移因子とはインサーションシーケンス(IS因子)、トランスポゾンを含む。変異型yggB遺伝子は、野生型のyggB遺伝子にインサーションシーケンス(IS因子)、トランスポゾンが偶然挿入されることによって取得できるものでもよいし、人工トランスポゾンを用いて、人為的に構築したものでもよい。転移因子が挿入された株は、例えばL-グルタミン酸アナログに対する感受性の低下を指標として選択することができる。L-グルタミン酸のアナログとしては、4-フルオログルタミン酸が利用できる。また、薬剤耐性遺伝子含む人工トランスポゾンを用いて薬剤耐性株をランダムに選択し、耐性株のyggB遺伝子長をPCRで確認することによっても転移因子挿入株を選択できる。
【0059】
人工トランスポゾンをコリネ型細菌に導入する方法としては、特開09-070291の方法が利用出来る。人工トランスポゾンとは、トランスポゼースの構造遺伝子、インサーションシーケンス(IS因子)の両端のインバーテッドリピート(IR)に挟まれたマーカー遺伝子のことを意味する。トランスポゼースの構造遺伝子は、人工トランスポゾンと同一のプラスミドに存在していてもよいし、別のプラスミド上に存在するものであってもよく、宿主の染色体上に存在するトランスポゾンの機能を利用してもよい。例えば、コリネ型細菌のトランスポゼースをコードする遺伝子として、以下のようなような配列が利用出来る。
【0060】
1.NCgl0179 Cgl0182;transposase
2.NCgl0235 Cgl0238;putative transposase
3.NCgl0348 Cgl0355;putative transposase
4.NCgl0688 Cgl0718;putative transposase
5.NCgl0919 Cgl0959;transposase
6.NCgl0993 Cgl1037;transposase
7.NCgl1021 Cgl1066;transposase
8.NCgl1464 Cgl1521;putative transposase
9.NCgl1496 Cgl1557;transposase
10.NCgl1662 Cgl1733;putative transposase
11.NCgl1664 Cgl1734;transposase
12.NCgl2131 Cgl2212;transposase
13.NCgl2284 Cgl2367;transposase
14.NCgl2392 Cgl2479;putative transposase
15.NCgl2418 Cgl2504;putative transposase
16.NCgl2420 Cgl2506;putative transposase
17.NCgl2460 Cgl2548;predicted transposase
18.NCgl2542 Cgl2631;predicted transposase
19.NCgl2665 Cgl2761;putative transposase
20.NCgl2748 Cgl2845;putative transposase
21.NCgl2850 Cgl2951;predicted transposase
【0061】
人工トランスポゾンは、適切なベクター、例えばプラスミドに搭載して宿主であるコリネホルム細菌に導入される。スクリーニングに用いる親株としては、ビオチンが過剰量含まれた条件でL-グルタミン酸を蓄積することが出来ない株、例えば、C.glutamicum野生株であるATCC13869株が望ましい。人工トランスポゾンを搭載するプラスミドとしては、特に制限はないが、通常コリネホルム細菌由来のプラスミドを用いればよい。具体的には、pHM1519(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))、pAM330(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))、及びこれらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド等である。さらに、導入された人工トランスポゾンを効率よく染色体上で増幅させるには、上記(1)に記載したような温度感受性複製起点を有するプラスミドを用いることが好ましい(特開平5-7491号参照)。
人工トランスポゾンを搭載したプラスミドをコリネホルム細菌に導入する方法としては、通常よく用いられるプロトプラスト法(Gene,39,281-286(1985))、エレクトロポーレーション法(Bio/Technology,7,1067-1070(1989))等の方法を用いればよい。
【0062】
人工トランスポゾンを温度感受性プラスミドに搭載してコリネホルム細菌へ導入する場合、構築したプラスミドでコリネホルム細菌を形質転換し、プラスミドの複製が可能な25℃で培養することにより、一細胞当り数十?数百コピーの人工トランスポゾン搭載プラスミドを増幅させて染色体への導入を行い、その後34℃で培養することにより余分なプラスミドを除去すればよく、この方法により効率よく染色体上での遺伝子の増幅が起こる。その他、人工トランスポゾンのみのDNA断片やコリネホルム細菌中で複製できないプラスミドベクター(例えばエシェリヒア・コリで複製するプラスミドベクター等)を用いてコリネホルム細菌の染色体に導入する方法もある。
(特開平7-107976号、Vertes,A.A.,Asai,Y.,Inui,M.,Kobayashi,M.,Kurusu,Y.and Yukawa,H.:Mol.Gen.Genet.,245,397-405(1994))。
【0063】
このようにして、染色体上に人工トランスポゾンが挿入した株を、ビオチンを過剰量含むL-グルタミン酸生産培地で培養し、L-グルタミン酸を蓄積する株を取得する。L-グルタミン酸を蓄積する株の染色体上のyggB遺伝子の塩基配列を決定することによって、変異型yggB遺伝子を有するコリネ型細菌を取得することが出来る。
【0064】
(II-3)in vitroでyggB遺伝子にランダムに変異を導入する方法
また、変異型yggB遺伝子は、in vitroでランダムに変異を導入し、その中から界面活性剤等の添加なしにL-グルタミン酸生産が可能となるクローンから選択することも出来る。スクリーニングに用いる親株としては、ビオチンが過剰量含まれた条件でL-グルタミン酸を蓄積することが出来ない株、例えば、C.glutamicum野生株であるATCC13869株、ATCC13032株、ATCC14067株、C.melasecola野生株であるATCC17965が望ましい。
【0065】
変異型遺伝子のスクリーニングを行うため、まずyggB欠損株を構築する。yggB遺伝子破壊株の構築は、上述のsacB遺伝子を用いる方法と同様の方法によって行うことが可能である。例えば、yggB遺伝子のコード領域に相補的なプライマー、例えば配列番号39に示す合成DNAと配列番号40に示す合成DNAをプライマーとして、C.glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、yggB遺伝子のN末端側断片を調製する。同様に配列番号41と配列番号42の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。配列番号40と41は互いに相補的である。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号39と配列番号42の合成DNAをプライマーとしてPCRを行えばyggB遺伝子のORFを欠失した断片を取得できる。
【0066】
得られたPCR断片はコリネ型細菌の遺伝子破壊用ベクター、例えばレバンシュークラーゼを搭載したpBS4Sに挿入することにより、欠損変異導入用のプラスミドが構築可能である。このようにして得られたyggB破壊用プラスミドをコリネ型細菌C.glutamicum ATCC13869株の染色体に挿入し、yggB欠損株を構築する。
【0067】
一方、yggB遺伝子の変異処理は以下のようにして行う。まず、コリネ型細菌で複製可能なプラスミドにyggB遺伝子をクローニングする。得られたyggB増幅ベクターを変異剤を含む緩衝液、例えば500mMリン酸緩衝液、400mMヒドロキシルアミン、1mM EDTA(pH6.0)に溶解し、75℃で60分から90分処理することにより変異を導入する。変異導入後のプラスミドは、SUPREC-02(タカラバイオ)等で脱塩した後、ATCC13869ΔyggB株に導入し、抗生物質を含む培地で形質転換体を選択する。また、対照として変異処理前のyggB増幅プラスミドについてもATCC13869ΔyggB株に導入する。出現した形質転換体を、ビオチンを過剰量含むL-グルタミン酸生産液体培地に接種し、しんとう培養したのち、グルタミン酸濃度を定量する。グルタミン酸は野生型のyggB増幅プラスミド導入株では殆ど増加しないが、変異処理したプラスミドを導入した株ではグルタミン酸を有意に蓄積する株が存在する。そのような株よりプラスミドを抽出し、そのyggB遺伝子の塩基配列を決定することで、新規な変異型yggB遺伝子が取得できる。また、またエラープローンPCR、DNA shuffling,StEP-PCRによって、遺伝子組換えにより人工的にyggB遺伝子に変異を導入して変異型yggB遺伝子を取得することも出来る。(Firth AE,Patrick WM;Bioinformatics.2005 Jun 2;Statistics of protein library construction.)
なお、上記のような染色体上のyggB遺伝子に変異を導入する方法としては、上述の方法以外に、コリネ型細菌にX線や紫外線を照射する方法、またはコリネ型細菌をN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。この方法によって、変異型yggB遺伝子が導入されたかどうかは、染色体上のyggB遺伝子の塩基配列を決定することやビオチンを過剰量含む培地でL-グルタミン酸を生成させることによって確認出来る。
【0068】
(II-4)L-グルタミン酸アナログ耐性株を取得する方法
変異型yggB遺伝子は、野生型のyggB遺伝子を有するコリネ型細菌をL-グルタミン酸アナログを含む培地で培養し、同培地で生育可能なL-グルタミン酸アナログ耐性株を取得することによっても取得することができる。スクリーニングに用いる親株としては、上述のコリネ型細菌野生株が好ましいが、野生型のyggB遺伝子を有するものであれば、いずれでもよい。また野生型のyggB遺伝子を搭載したプラスミドを有するコリネ型細菌でもよい。
L-グルタミン酸アナログとしては、L-グルタミン酸-γ-メチルエステル、α-メチルグルタミン酸、β-ヒドロキシグルタミン酸、メチオニンスルホキシミン、グルタミン酸-γ-モノヒドロキサメート、2-アミノ-4-ホスホノ酪酸、L-グルタミン酸-γ-モノエチルエステル、L-グルタミン酸ジメチルエステル、L-グルタミン酸-ジ-t-ブチルエステル、モノフロログルタミン酸、L-グルタミン酸ジエチルエステル、D-グルタミン酸、4-フルオログルタミン酸が挙げられ、特に4-フルオログルタミン酸アナログが使用できる。
L-グルタミン酸アナログ耐性株は以下のような手法で行う。コリネ型細菌をL-グルタミン酸アナログを添加した最小培地に接種し、24時間?48時間後にコロニーを形成した株を取得する。培地中に含まれるL-グルタミン酸アナログの濃度は、yggB遺伝子が改変されていないコリネ型細菌が生育できず、yggB遺伝子に変異が導入されたコリネ型細菌が生育できる濃度が好ましい。より具体的には、4-フルオログルタミン酸を用いる場合は、1.25mM、好ましくは2.5mM、より好ましくは5mMが好ましい。ここで、本発明のL-グルタミン酸アナログ耐性とは、最少培地に4-フルオログルタミン酸を添加して一昼夜培養した際に、親株の生菌数(コロニー形成能を有する菌数)を1/100まで抑制できるような濃度においても1/10以上の増殖を示すことを意味する。
取得できたL-グルタミン酸アナログ耐性株をビオチンを過剰量含むL-グルタミン酸生産液体培地に接種し、しんとう培養したのち、グルタミン酸濃度を定量する。L-グルタミン酸は野生株では殆ど増加しないが、L-グルタミン酸アナログ耐性株では、L-グルタミン酸を有意に蓄積する株が存在する。そのような株よりyggB遺伝子をPCRによって増幅し、そのyggB遺伝子の塩基配列を決定することで、新規な変異型yggB遺伝子が取得できる。
【0069】
<III> 本発明の変異型yggB遺伝子
以下、変異型yggB遺伝子の具体例を挙げる。ただし、変異型yggB遺伝子は、コリネ型細菌においてビオチンが過剰量存在する条件で、L-グルタミン酸生産能を向上させうる変異であれば特に制限されない。
【0070】
(III-1)C末端側変異
この変異は、配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸番号419-533の配列、または配列番号62のアミノ酸番号419-529の配列をコードする領域の塩基配列の一部に導入された変異である。例えば、この領域は、配列番号5の塩基配列においては、塩基番号2692-3035番目に相当する。上記領域の塩基配列中の少なくとも一部に変異が導入されていればいずれでもよいが、インサーションシーケンス(以下ISという)や、トランスポゾンが挿入されたものが好ましい。変異は、アミノ酸置換を伴うもの(ミスセンス変異)や、上記ISの挿入によってフレームシフト変異が導入されたもの、ナンセンス変異が導入されたものの何れでもよい。
【0071】
(III-1-1) 転移因子の挿入による変異(2A-1型変異)
C末端側変異の一例として、配列番号5の2691番目のGの次にISが挿入された変異が挙げられる。この変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号7に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号8に示す。配列番号8においては、配列番号6の419位のバリンから下流の領域が短いISに由来する配列に置換されている。なお、配列番号7にて挿入されたISは、IS1207(Genbank accession No.X96962)、IS719:(Genbank accession No E12759)と相同性の高い配列である。
上記変異型yggB遺伝子を2A-1型変異と呼ぶ。2A-1型変異には、配列番号6、62、68、84および85のC末端側の該領域を欠失または置換する変異が含まれる。
また、上記領域に他のISが挿入されたもの、例えば上述したようなtransposaseをコードするISが挿入されたものも、本発明の範囲に含まれる。transposaseが導入される位置は上記領域のいずれの位置でもよいが、それぞれのtransposaseが認識しやすい箇所やISが挿入しやすいホットスポットの位置が好ましい。
【0072】
(III-1-2)プロリン残基を他のアミノ酸に置換する変異(66型変異、22型変異)
またC末端側変異の一例として、配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸番号419-533の配列、または配列番号62のアミノ酸番号419-529の領域内に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異が挙げられる。置換してもよいプロリンは、配列番号6の以下の位置に存在する。
424番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の424番目)
437番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の437番目)
453番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の453番目)
457番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の457番目)
462番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の462番目)
469番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の469番目)
484番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の484番目)
489番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の489番目)
497番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の497番目)
515番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の515番目)
529番目のプロリン残基(配列番号68、84、85の529番目、配列番号62番目の525番目)
533番目のプロリン残基(配列番号68、84、85の533番目、配列番号62番目の529番目)
yggB遺伝子のC末端側のプロリン残基は、YggBタンパク質の立体構造維持の為に重要な役割を果たしていると考えられる。(Protein Eng.2002 Jan;15(1):29-33、J Biol Chem.1991 Dec 25;266(36):24287-94.)
中でも424番目と437番目のプロリンが他のアミノ酸に置換することが望ましい。
ここで他のアミノ酸とは、プロリン以外のアミノ酸で天然型アミノ酸であればいずれのアミノ酸でもよく、Lys,Glu,Thr,Val,Leu,lle,Ser,Asp,Asn,Gln,Arg,Cys,Met,Phe,Trp,Tyr,Gly,Ala,Hisから選択される残基に置換すればよい。特に、424番目のプロリンは、疎水性アミノ酸であるAla、Gly、Val、Leu、Ileに置換されることが望ましく、中でも分岐鎖アミノ酸であるLeu、Val、Ileが望ましい。(66型変異)424番目のプロリンをロイシンに置換する変異として、例えば、配列番号67の1673位の“C”を“T”に置換する変異が挙げられる。この変異型yggB遺伝子を配列番号69に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号70に示す。
また、437番目のプロリンは、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸(Thr,Ser,Tyr)に置換することが望ましく、中でもSerへの置換が望ましい。(22型変異)437番目のプロリンをセリンに置換する変異としては、例えば配列番号5の2745位のCをTに置換する変異が挙げられる。また、本変異は、3060位のCをTに置換する変異を伴っていてもよい。この変異型yggB遺伝子を配列番号73に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号74に示す。
【0073】
(III-2)膜貫通領域の変異
yggB遺伝子がコードするYggBタンパク質は、5個の膜貫通領域を有していると推測される。配列番号6、62、68、84、85の野生型のYggBタンパク質のアミノ酸配列において、膜貫通領域はそれぞれ、アミノ酸番号1?23(第1膜貫通領域)、25?47(第2膜貫通領域)、62?84(第3膜貫通領域)、86?108(第4膜貫通領域)、110?132(第5膜貫通領域)の領域に相当する。これらをコードするDNAは配列番号5の1437-1505、1509-1577、1620-1688、1692-1760、1764-1832番目の塩基に該当する。本発明の変異は、この膜貫通領域をコードするDNA内に変異を有していることが望ましく、変異導入は1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入又は逆位を含む変異で、フレームシフト変異、ナンセンス変異を伴わないものが望ましい。従って、ここでアミノ酸配列の置換の場合は、アミノ酸置換を伴うミスセンス変異が好ましく、上記数個の
置換、欠失、付加、挿入又は逆位とは、2?20個、好ましくは2?10個、より好ましくは2?5個、さらに好ましくは2?3個を意味する。またアミノ酸の挿入、欠失変異は、1?数塩基のポイントミューテーションの導入や、フレームシフト変異を伴わない塩基配列導入、例えば、3,6,9,12,15,18、または21塩基の挿入または欠失、好ましくは、3,6、または9塩基の欠失または挿入、より好ましくは3塩基の塩基配列の欠失または挿入が望ましい。
【0074】
例えば、以下のような変異が例として挙げられる。
(III-2-1)第1膜貫通領域の変異(A1型変異)
この変異は、配列番号6、62、68、84、85に示されるアミノ酸配列において、14番目のロイシン残基、15番目のトリプトファン残基間に1又は数アミノ酸挿入された変異である。
具体例としては、14番目のロイシン残基、15番目のトリプトファン残基間に、3アミノ酸導入されたもの、例えばCys-Ser-Leuが挿入されたものが挙げられ、この変異の例として、配列番号5の1480番目のGの次にTTCATTGTGが挿入された変異が挙げられる。この変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号19に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号20に示す。
【0075】
(III-2-2)第4膜貫通領域の変異(19型変異)
この変異は、配列番号6、62、68、84、85に示されるアミノ酸配列において、100番目のアラニン残基が、他のアミノ酸残基へ置換した変異である。他のアミノ酸とは、アラニン以外のアミノ酸残基であればいずれでもよく、他のアミノ酸とはアルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、バリン、スレオニンを意味するが、中でも側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸(スレオニン、セリン、チロシン)に置換されていることが望ましく、特にスレオニン残基に置換されていることが望ましい。一例として配列番号5の1734番目のGがAに置換された変異が挙げられる。
この変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号21に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号22に示す。
【0076】
(III-2-3)第5膜貫通領域の変異(L30型変異、8型変異)
この変異は、配列番号6、62、68、84、85に示されるアミノ酸配列において、111番目のアラニン残基が、他のアミノ酸残基へ置換した変異である。他のアミノ酸とは、アラニン以外のアミノ酸残基であれば、いずれでもよく、他のアミノ酸とはアルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、バリン、スレオニンを意味するが、中でも分岐鎖アミノ酸(バリン、イソロイシン、ロイシン)、特にバリン残基や、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸(スレオニン、セリン、チロシン)、特にスレオニン残基に置換されていることが望ましい。この変異の例として、配列番号5の1768番目のCがTに置換された変異(L30型変異)や、配列番号61の837番目のGがAに置換された変異(8型変異)が挙げられる。L30型変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号23に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号24に示す。8型変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号63に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号64に示す。
【0077】
上記の「変異型yggB遺伝子」は、ビオチンが過剰量存在する条件におけるL-グルタミン酸生産能を向上させる機能を有する限り、上述の変異を含む機能的に均等な遺伝子、例えば、配列番号7の塩基番号1437?2705の塩基配列を含むDNA、配列番号19の塩基番号1437?3044の塩基配列を含むDNA、配列番号21の塩基番号1437?3035の塩基配列を含むDNA、配列番号23の塩基番号1437-3035の塩基配列を含むDNA、配列番号63の塩基番号507-2093の塩基配列を含むDNA、配列番号69の塩基番号403-2001の塩基配列を含むDNA、配列番号73の塩基番号548-2146の塩基配列を含むDNAのような変異型遺伝子と実質的に相同な遺伝子で、これらと相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該塩基配列の一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここでストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件のことをいう。例えば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件が挙げられ、具体的には、60℃、0.1×SSC、0.1%SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度、温度で、1回より好ましくは2?3回洗浄する条件が挙げられる。
【0078】
変異型yggB遺伝子がコードするタンパク質としては、同タンパク質の活性がビオチンが過剰量存在する条件においてL-グルタミン酸生産能を向上させる機能を有する限り、機能的に均等なタンパク質例えば、配列番号8、20、22、24、64,70,74から選択されるアミノ酸配列において、上記変異点のアミノ酸以外にさらに、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで、数個とは、例えば、2?20個、好ましくは2?10個、より好ましくは2?5個を意味する。上記置換は保存的置換(中性変異)が好ましく、保存的置換としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。また、上述したように、配列番号85のXaaのアミノ酸が置換されてもよい。さらに、本発明のyggB遺伝子は、配列番号8、20、22、24、64,70,74のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌で変異型yggBがコードするタンパク質と同等の活性を有するタンパク質をコードするホモログも含む。
【0079】
特に、以下のアミノ酸は配列番号8、20、22、24、64,70,74のアミノ酸配列において置換されていてもよい。
48位のGlu(好ましくはArgによる置換)
275位のAsp(好ましくはSerによる置換)
298位のGlu(好ましくはAlaによる置換)
343位のAla(好ましくはValによる置換)
396位のPhe(好ましくはIleによる置換)
438位のSer(好ましくはGlyによる置換)
445位のVal(好ましくはAlaによる置換)
454位のAla(好ましくはValによる置換)
457位のPro(好ましくはSerによる置換)
474位のSer(好ましくはAspによる置換)
517位のVal(好ましくは欠失)
518位のGlu(好ましくは欠失)
519位のAla(好ましくは欠失)
520位のPro(好ましくは欠失)
【0080】
<V> 変異型yggB遺伝子のコリネ型細菌への導入方法
上記のような変異を有する変異型yggB遺伝子は、例えば、部位特異的変異導入法などによって得ることができる。より具体的には、yggB遺伝子の該当領域に変異を含む配列を有するPCRプライマーを用いて、該当箇所を増幅するオーバーラップエクステンションPCR法などを用いて、変異を含むyggB遺伝子を増幅してクローニングすることができる(Urban,A.,Neukirchen,S.and Jaeger,K.E.,A rapid and efficient method for site-directed mutagenesis using one-step overlap extension PCR.Nucleic Acids Res,25,2227-8.(1997).)。
得られた変異型yggB遺伝子をコリネ型細菌に導入することにより本発明のコリネ型細菌を得ることができる。導入の方法としては、変異型yggB遺伝子で染色体上の野生型のyggB遺伝子を置換する方法が挙げられる。染色体上の野生型のyggB遺伝子を破壊した株に変異型yggB遺伝子を導入してもよい。なお、一回組換え株のように、野生型のyggB遺伝子を染色体上に残したまま、変異型yggB遺伝子を導入してもよく、野生型遺伝子と、変異型遺伝子が組み込まれる1コピーずつ染色体上に存在してもよい。染色体上のyggB遺伝子の置換は、例えば、上述したレバンシュークラーゼをコードするsacB遺伝子を含む温度感受性プラスミドを用いて行うことができる。
【0081】
本発明のコリネ型細菌は、変異型yggB遺伝子を導入することにより、L-グルタミン酸アナログに対する耐性が向上したものであってもよい。本発明でL-グルタミン酸アナログとは、L-グルタミン酸-γ-メチルエステル、α-メチルグルタミン酸、β-ヒドロキシグルタミン酸、メチオニンスルホキシミン、グルタミン酸-γ-モノヒドロキサメ-ト、2-アミノ-4-ホスホノ酪酸、L-グルタミン酸-γ-モノエチルエステル、L-グルタミン酸ジメチルエステル、L-グルタミン酸-ジ-t-ブチルエステル、モノフロログルタミン酸、L-グルタミン酸ジエチルエステル、D-グルタミン酸、4-フルオログルタミン酸が挙げられる。L-グルタミン酸アナログに対する耐性の向上とは、最少培地に4-フルオログルタミン酸を添加して一昼夜培養した際に、親株の生菌数(コロニー形成能を有する菌数)を1/100まで抑制できるような濃度においても1/10以上の増殖を示すことをいう。具体的には、1.25mM、好ましくは2.5mM、より好ましくは、5mM以上の4-フルオログルタミン酸に耐性を有することを意味する。
【0082】
さらに上記変異型yggB遺伝子の機能を抑制する遺伝子が不活化するように改変された細菌を用いてもよい。ここで「yggB遺伝子の機能を抑制する」とは、その遺伝子の増幅により変異型yggB遺伝子導入株のグルタミン酸生成を抑制することを意味する。変異型yggB遺伝子の機能を抑制する遺伝子とは、symA遺伝子が挙げられる(supresser of yggB mutation)。symA遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のGenbank Accession No.NC_003450として登録されているゲノム配列中の塩基番号2051306..2051845にコードされており、NCgl 1867として登録されている(NP_601149.hypothetical prot...[gi:19553147])。C.glutamicum ATCC13869のsymA遺伝子を配列番号86の塩基番号585?1121に示す。遺伝子の不活化は、遺伝子を破壊するあるいは、発現量を低下するように改変することで達成でき、symA遺伝子の破壊や発現量を低下させるような変異の導入は、上述の酵素活性の低下と同様の方法で行うことができる。
【0083】
また、本発明においては、yggB遺伝子を用いた改変に加えて、さらにα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ(以下α-KGDHと呼ぶ)の活性が低下するように改変された細菌を用いてもよい。「α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下する」とは、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して低下していることをいう。α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性は、Shiioらの方法(Isamu Shiio and Kyoko Ujigawa-Takeda,Agric.Biol.Chem.,44(8),1897-1904,1980)に従って測定する
ことができる。α-KGDH活性は、野生株又は親株等の非改変株に対して低下していればよいが、親株に対して約1/2以下、好ましくは1/4以下、さらに好ましくは1/10以下に低下していることが望ましく、全く活性を有しなくてもよい。
【0084】
α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下したコリネ型細菌は、上述した方法を用いて構築することが出来る。
中でもチアミンピロリン酸結合領域(配列番号43の2498番目?2584番目の塩基によってコードされる領域(配列番号44の686Gly-714Asp))に変異を導入することが好ましい。
例えば、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した株として、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株(国際公開WO95/34672号パンフレット)や、 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム AJ12821(FERM BP-4172)株(特開平06-237779)が挙げられる。尚、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの弱化と変異型yggB遺伝子の導入は、どちらを先に行ってもよい。
【0085】
<3> 本発明のL-グルタミン酸の製造方法
上記のようにして得られるコリネ型細菌をを培地に培養し、培地中にL-グルタミン酸を生成蓄積せしめ、L-グルタミン酸を該培地から採取することにより、L-グルタミン酸を製造することが出来る。
【0086】
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
【0087】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。
また、用いるyggB遺伝子改変株の性質にあわせて適当な濃度の界面活性剤、ペニシリンを加えてもよいし、用いるyggB遺伝子改変株の性質にあわせてビオチン濃度も調節すればよい。
【0088】
培養は、好ましくは、発酵温度20?45℃、pHを3?9に制御し、通気培養を行う。培養中にpHが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。このような条件下で、好ましくは10時間?120時間程度培養することにより、培養液中に著量のL-グルタミン酸が蓄積される。
【0089】
また、L-グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にL-グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。L-グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、pH5.0?4.0、好ましくはpH4.5?4.0、さらに好ましくはpH4.3?4.0、特に好ましくはpH4.0を挙げることができる。(欧州特許出願公開第1078989号明細書)
【0090】
培養終了後の培養液からL-グルタミン酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。L-グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したL-グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているL-グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【0091】
[実施例]
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されない。
【実施例1】
【0092】
<sacB搭載遺伝子破壊用ベクターの構築>
(A)pBS3の構築
sacB搭載遺伝子破壊用ベクターの構築は、国際公開WO2005113745号、WO2005113744号の方法を参照にして行った。sacB遺伝子(配列番号11)をバチルス・ズブチリスの染色体DNAを鋳型として配列番号13と14をプライマーとして用いて、PCRにより取得した。PCR反応は、LA taq(TaKaRa)を用い、94℃で5分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 30秒、会合49℃ 30秒、伸長72℃ 2分からなるサイクルを25回繰り返した。生成したPCR産物を常法により精製後BglIIとBamHIで消化し、平滑化した。この断片をpHSG299のAvaIIで消化後、平滑化した部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル(宝バイオ社製)を用いて形質転換を行い、カナマイシン(以下、Kmと略す)25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS3と命名した。pBS3の構築過程を図1に示す。
【0093】
(B)pBS4Sの構築
pBS3上に存在するカナマイシン耐性遺伝子配列中のSmaI部位をアミノ基置換を伴わない塩基置換(SmaIにより切断されない変異)によりカナマイシン耐性遺伝子を破壊したプラスミドをクロスオーバーPCRで取得した。まず、pBS3を鋳型として配列番号15,16の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、カナマイシン耐性遺伝子のN末端側の増幅産物を得る。一方Km耐性遺伝子のC末端側の増幅産物を得るためにpBS3を鋳型として配列番号17,18の合成DNAを鋳型としてPCRを行った。PCR反応はPyrobest DNA Polymerase(宝バイオ社製)を用い、98℃で5分保温を1サイクル行った後、変性98℃ 10秒、会合57℃ 30秒、伸長72℃ 1分からなるサイクルを25回繰り返すことにより目的のPCR産物を得ることができる。配列番号16と17は部分的に相補的であり、またこの配列内に存在するSmaI部位はアミノ酸置換を伴わない塩基置換を施すことにより破壊されている。次にSmaI部位が破壊された変異型カナマイシン耐性遺伝子断片を得るために、上記カナマイシン耐性遺伝子N末端側及びC末端側の遺伝子産物を、それぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号15,18の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い変異導入されたKm耐性遺伝子増幅産物を得た。PCR反応はPyrobest DNAPolymerase(宝バイオ社)を用い、98℃で5分保温を1サイクル行った後、変性98℃ 10秒、会合57℃ 30秒、伸長72℃ 1.5分からなるサイクルを25回繰り返すことにより目的のPCR産物を得ることができる。
【0094】
PCR産物を常法により精製後BanIIで消化し、上記のpBS3のBanII部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル(宝バイオ社製宝バイオ社製)を用いて形質転換を行い、カナマイシン25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4Sと命名した。pBS4Sの構築過程を図2に示す。
【実施例2】
【0095】
<C.glutamicum ATCC13869由来odhA変異株の構築> コリネ型細菌のα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードしているodhA遺伝子の配列は既に明らかにされている(Microbiology 142,3347-3354,(1996)、GenBank accession No.D84102)。公開されているodhA遺伝子の配列を基に、配列番号1、2に記載のプライマーを設計しATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、odhA遺伝子の内部配列のみを増幅した。増幅したPCR断片をBamHIで完全分解し、実施例1で構築したpBS4SのBamHI部位に挿入したプラスミドpBS4SΔsucAintを構築した(構築図は図3に記載)。
【0096】
電気パルス法(特開平2-207791)にてC.glutamicum ATCC13869へpBS4SΔsucAintを導入し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex寒天培地(グルコース5g/l、ポリペプトン10g/l、酵母エキス10g/l、KH_(2)PO_(4) 1g/l、MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l、FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l、MnSO_(4)・4-5H_(2)O 0.01g/l、尿素3g/l、大豆蛋白加水分解液1.2g/l、寒天20g/l、NaOHを用いてpH7.5に調整:オートクレーブ120℃20分)上に塗布した。31.5℃にて培養後、生育してきた株を、相同組換えによって染色体上にpBS4SΔsucAintが組み込まれた1回組換え株であることをPCRにて確認した。なお1回組換え株であることの確認は、候補株の染色体を鋳型にし、pBS4S上の特異的配列(配列番号3)と染色体上の配列(配列番号4)をプライマーにしたPCRを行うことによって、容易に確認することが出来る(非組み換え株の染色体上にはpBS4Sの配列が存在していないため、PCRによって増幅される断片が出現しないことから判別可能となる)。
【0097】
こうして取得した1回組換え株を2A-1株と名付けた。野生株ATCC13869および2A-1株を20mlのフラスコ培地(グルコース30g/l,硫酸アンモニウム 15g/l,KH_(2)PO_(4) 1g/l,MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l,FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l,MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l,VB1 200μg/l,Biotin 300μg/l,大豆加水分解物(T-N)0.48g/l,KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費したのち、培地中のL-グルタミン酸濃度を測定した。結果を表1に示す(OD620は101倍希釈の濁度で菌体量の指標であり、Glu(g/L)はL-グルタミン酸の蓄積量を示す)。親株のATCC13869ではL-グルタミン酸を全く生成しない条件においても2A-1株ではL-グルタミン酸生産能を有することが確認された。
【0098】
【表1】

【実施例3】
【0099】
<2A-1由来odhA復帰株の構築>
取得した2A-1株は、染色体上のodhA遺伝子がpBS4SΔT¥sucAintによって破壊されている。この株から染色体上のプラスミドを脱落させればodhAは野生型に復帰する。一方、odhAが欠損した株では、糖を含まない培地での生育が著しく遅いが、odhAが野生型に復帰すれば糖を含まないCM2B(ポリペプトン10g/l、酵母エキス10g/l、NaCl 5g/l、Biotin 10μg/L、寒天20g/l、KOHを用いてpH7.0に調整)のような培地でも良好に生育すると推測される。そこで、2A-1株をCM2Bプレートに塗布し、生育改善株を誘導した。こうして出現した生育改善株2A-1R株をCM2Bプレートで純化し、そのカナマイシン感受性を調べたところ、すべてカナマイシン感受性であり、スクロース耐性であることが明らかとなった。
【0100】
pBS4SΔsucAintにはカナマイシン耐性遺伝子とレバンシュークラーゼをコードするsacB遺伝子が含まれているため、pBS4SΔsucAintを有する株ではカナマイシン耐性とスクロース感受性を示し、脱落した株ではカナマイシン感受性を示し、またスクロース耐性を示すこととなる。これらの結果から2A-1R株ではodhAが野生型に復帰していることが示唆された。さらにodhA遺伝子の配列を確認した結果、odhA遺伝子には変異がないことが確認されたことから、2A-1R株ではodhAは野生型に復帰していると結論した。2A-1R株のグルタミン酸生産能を実施例2と同様の方法で確認した。結果を表2に示す。(OD620は101倍希釈の菌体量、Glu(g/L)はL-グルタミン酸の蓄積量を示す)2A-1R株のグルタミン酸蓄積は2A-1株には劣るものの野生株ATCC13869よりも遥かに高いことが示された(表2)。また、糖を完全に消費した後も振とうを続けたところ、2A-1Rではグルタミン酸の分解が認められ、odhAが野生型に復帰していることが裏付けられた(図4)。
【0101】
【表2】

【実施例4】
【0102】
<2A-1R株のグルタミン酸生成に関与する遺伝子の単離>
2A-1R株は、CM2Bプレート培地上においては、野生株ATCC13869とほぼ変わらない速度でコロニーを形成できる。しかし、最少培地(グルコース20g/l,硫酸アンモニウム2.64g/L,KH_(2)PO_(4) 0.5g/L,K_(2)HPO_(4) 0.5g/L,MgSO_(4)・7H_(2)O 0.25g/L,FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/L,MnSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/L,CaCl_(2) 0.01g/L,CuSO_(4) 0.02mg/L,MOPS 40g/L,プロトカテク酸30mg/L,VB_(1)・HCl200μg/L,Biotin 300μg/L,寒天20g/L,NaOHを用いてpH6.7に調整)プレート上では野生株ATCC13869に比し著しくコロニー形成速度が低下していることが明らかとなった。そこで、最少培地で2A-1R株の生育を回復できる遺伝子の探索をおこなった。
【0103】
ATCC13869株の染色体DNAをSau3AIで部分分解し、シャトルベクターpVK9をBamHIで処理したものとライゲーションし、ライゲーション反応液をエタノール沈殿した後、E.coli DH5α(タカラバイオ)のエレクトロコンピテントセルを電気パルス法で形質転換した。pVK9は、pHSG299(タカラバイオ)のAvaII部位を平滑末端化し、pHK4(特開平05-007491)に含まれるコリネ型細菌内で自律複製可能な領域をBamHIおよびKpnIで切り出し平滑末端化した断片を挿入したシャトルベクターである。形質転換後の菌体はカナマイシン25μg/mlを含むLBプレート培地(ポリペプトン10g/l、酵母エキス5g/l、NaCl 5g/l、寒天20g/l、NaOHを用いてpH7.0に調整)に塗布し、37℃で一晩培養した。翌日出現したコロニーを全てエーゼでかきとり、プラスミドを抽出しATCC13869のライブラリーとした。このライブラリーを実施例3で得られた2A-1R株に電気パルス法にて形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含む最少培地プレートに塗布し、コロニー形成速度が向上した株をスクリーニングした。コロニー形成速度が向上した株よりプラスミドを抽出した結果、配列番号5に記す断片がpVK9のBamHI部位に挿入されていたことが明らかとなった。このプラスミドをpL5kと命名した。
【0104】
pL5kの挿入配列と、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のゲノム配列(Acc.No.NC_003450)を比較した結果、pL5kには完全長のORFとして、配列番号6に示すアミノ酸配列をもつORFのみが含まれていることが明らかとなった。ORFが膜タンパク質か否かは、インターネット上で利用可能なプログラム「SOSUI」によって予測可能である(2004/10/07現在http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0E.htmlにリンクされている)。「SOSUI」でこのORFを解析した結果、5回の膜貫通領域が存在していることが示唆された。配列番号6のアミノ酸配列において、膜貫通領域はそれぞれ、アミノ酸番号1?23、25?47、62?84、86?108、110?132の領域に相当する。これらをコードするDNA配列は、配列番号5の1437-1505、1509-1577、1620-1688、1692-1760、1764-1832番目の塩基配列に、膜貫通領域のアミノ酸配列は配列番号25-29、表3に示した
【0105】
【表3】

【0106】
さらに公知の文献を調べた結果、このORFはYggB(NCgl 1221)として解析されているORFであることが明らかとなった(FEMS Microbiology letters 218(2003)305-309)。
【実施例5】
【0107】
<2A-1R株のYggB遺伝子の変異点同定>
2A-1R株の最少培地における生育をpL5Kが相補したことから、2A-1R株のyggB遺伝子には何らかの変異がある可能性が示唆された。そこで、2A-1R株のyggB遺伝子の塩基配列を決定した。その結果2A-1R株ではYggB遺伝子のC末端側の領域にISが挿入されていることが明らかとなった(図5)。2A-1R株の変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号7に、アミノ酸配列を配列番号8に記した。このことから、2A-1R株のグルタミン酸生産能は、yggB遺伝子の変異によって維持されていた可能性が示唆された。なお、この変異は2A-1R株のみならず2A-1株にも存在していた。odhA遺伝子に変異を導入した際に、安定してグルタミン酸を細胞外に放出するためのサプレッサー変異として起こった変異であると推測される。ここで、ISが挿入されたこの変異を、2A-1型変異とした。
【実施例6】
【0108】
<2A-1型yggB変異株構築とL-グルタミン酸生産能評価>
(6-1) 2A-1型変異の野生株への導入と評価(1回組換え株)
2A-1株の染色体DNAを鋳型として、配列番号9と配列番号10に示す合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、2A-1型変異を有するyggB遺伝子断片を増幅した。増幅産物はSacIで処理し、実施例1のpBS3のSacI部位に挿入した。2A-1型変異を有するyggB断片がクローニングされたプラスミドをpBS3yggB2Aと名付けた。
電気パルス法にてC.glutamicum ATCC13869にpBS3yggB2Aを導入し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex寒天培地上に塗布した。31.5℃にて培養後生育してきた株を、相同組換えによって染色体上にpBS3yggB2Aが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。得られた一回組換え株を13869-2Aとした。この株では、野生型のyggB遺伝子と変異型のyggB遺伝子の両方が発現していることとなる。
【0109】
取得したyggB変異導入株13869-2Aのグルタミン酸生産能を、実施例2記載の方法にて確認した。その結果を表4に示す(OD620は101倍希釈の菌体量、Glu(g/L)はL-グルタミン酸の蓄積量を示す)。13869-2A株では、ATCC13869株がL-グルタミン酸を生成しない条件でも、明確なグルタミン酸生産能が確認できた。このことから、YggB遺伝子の変異により、グルタミン酸生産が誘導できることが示された。
【0110】
【表4】

【0111】
(6-2)2A-1型変異の野生株への導入と評価(2回組換え株)
変異型遺伝子のみを有する株を構築する為、13869-2A株をCM-Dex液体培地で一夜培養した懸濁液をS10寒天培地(スクロース100g/l、ポリペプトン10g/l、酵母エキス10g/l、KH_(2)PO_(4) 1g/l、MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l、FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l、MnSO_(4)・4-5H_(2)O 0.01g/l、尿素3g/l、大豆蛋白加水分解液1.2g/l、寒天20g/l、NaOHを用いてpH7.5に調整:オートクレーブ120℃20分)上に塗布し31.5℃で培養した。出現したコロニーのうち、カナマイシン感受性を示す株をs2B寒天培地上で純化した。これらの株より染色体DNAを調整し、配列番号9と配列番号10に示す合成DNAをプライマーとしてPCRを行い変異を確認し、yggB遺伝子にIS様配列が挿入されていた株を13869-2A-7とした。
【0112】
取得した13869-2A-7株のグルタミン酸生産能を、実施例2記載の方法にて確認した。その結果を表5に示す。(OD620は101倍希釈の菌体量、Glu(g/L)はL-グルタミン酸の蓄積量を示す)。13869-2A-7株では、2A-1R株と同等以上のグルタミン酸生産能を示したことから、ビオチン過剰量存在下でのL-グルタミン酸生産は、yggB遺伝子の変異によって引き起こされることが確認できた。
【0113】
【表5】

【実施例7】
【0114】
< A1型YggB変異株の構築と評価>
上述のL-グルタミン酸生産性のodhA変異株を解析した結果、上述の2A-1変異の他にyggB遺伝子上に5種類の変異を見出した。以下、それぞれA1型変異、19型変異、L30型変異、8型変異、66型変異とし、前者3つについてはATCC13869の染色体に変異を導入して効果を確認した。8型変異についてはATCC14067の染色体に変異を導入して効果を確認した。66型変異に関しては、C.melassecola ATCC17965の染色体に変異を導入して効果を確認した。
【0115】
A1型変異は、配列番号5の1480番目のGの次にTTCATTGTGが挿入された変異であり、配列番号6のアミノ酸配列の14番目のロイシン残基、15番目のトリプトファン残基間にシステイン、セリン、ロイシン残基が挿入された変異である。この変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号19に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号20に示す。
【0116】
A1型変異遺伝子の取得は次のようにすれば行うことが出来る。配列番号30に示す合成DNAと配列番号31に示す合成DNAをプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製する。同様に配列番号32と配列番号33の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号9と配列番号34の合成DNAをプライマーとしてPCRを行えばA1型YggB遺伝子の部分断片を取得できる。得られたYggB断片はSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドが構築可能である。このようにして得られたpBS4 YggBA1を実施例6記載の方法と同様にATCC13869株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、A1型に置換されていた株を選択すれば、A1型変異を有する株を構築することができる。このような変異を持つA1型変異株をATCC13869-A1株とした。
【0117】
ATCC13869-A1株と親株のATCC13869株を実施例2と同様の方法で培養を行った。培養終了後、培養液中に含まれるL-グルタミン酸の量を公知の方法で測定した。
A1変異を染色体上に導入した、ATCC13869-A1株は親株のATCC13869株と比べてL-グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
【0118】
【表6】

【実施例8】
【0119】
<19型YggB変異株の構築と評価>
19型変異は、配列番号5の1734番目のGがAに置換された変異であり、配列番号6のアミノ酸配列の100番目のアラニンがスレオニンに置換された変異である。この変異が導入された変異型YggB遺伝子の塩基配列を配列番号21に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号22に示す。実施例7と同様の方法にて、19型変異が導入されたyggB変異株を構築した。具体的には、配列番号30に示す合成DNAと配列番号35に示す合成DNAをプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製する。同様に配列番号33と配列番号36の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号9と配列番号34の合成DNAをプライマーとしてPCRを行えば19型YggB遺伝子の部分断片を取得できる。得られたYggB断片はSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドが構築可能である。このようにして得られたpBS4 YggB19を実施例6記載の方法と同様にATCC13869株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、19型に置換されていた株を選択すれば、19型変異を有する株を構築することができる。このような変異を持つ19型変異株をATCC13869-19株とした。
【0120】
ATCC13869-19株と親株のATCC13869株を実施例2と同様の方法で培養を行った。培養終了後、培養液中に含まれるL-グルタミン酸の量を公知の方法で測定した。19変異を染色体上に導入した、ATCC13869-19株は親株のATCC13869株と比べてL-グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
【0121】
【表7】

【実施例9】
【0122】
<L30型YggB変異株の構築>
L30型変異は、配列番号5の1768番目のCがTに置換された変異であり、配列番号6の111番目のアラニンがバリンに置換された変異である。この変異が導入された変異型YggB遺伝子の塩基配列を配列番号23に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号24に示す。
実施例7と同様の方法にて、L30型変異が導入されたyggB変異株を構築した。具体的には、配列番号30に示す合成DNAと配列番号37に示す合成DNAをプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製する。同様に配列番号34と配列番号38の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号9と配列番号34の合成DNAをプライマーとしてPCRを行ないL30型YggB遺伝子の部分断片を取得する。得られた変異型YggB断片はSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドを構築した。このようにして得られたpBS4 YggB-Lを実施例6記載の方法と同様にATCC13869株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、L30型に置換されていた株を選択し、L30型変異を有する株を構築した。このような変異を持つL30型変異株をATCC13869-L株とした。
【0123】
ATCC13869株と、ATCC13869-L株を実施例2と同様の方法で培養を行い、培養終了後、培養液中に含まれるL-グルタミン酸の量を公知の方法で測定した。結果を表8に示す。(OD620は101倍希釈の菌体量、Glu(g/L)はL-グルタミン酸の蓄積量を示す)。L-30変異を導入したATCC13869-L30株は親株のATCC13869株と比べてL-グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
【0124】
【表8】

【実施例10】
【0125】
<変異型yggB遺伝子導入株のL-グルタミン酸生成条件における培養評価>
コリネ型細菌はTween40等の脂肪酸系界面活性剤の添加や、ビオチン制限によりグルタミン酸生成を誘導できる。そこで、ATCC13869株とATCC13869-19株について、Tween40添加条件およびビオチン制限条件での培養も行った。シード培養は、20mlのフラスコ培地(グルコース80g/l,硫酸アンモニウム 30g/l,KH_(2)PO_(4) 1g/l,MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l,FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l,MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l,VB1 200μg/l,Biotin 60μg/l,大豆加水分解物(T-N)0.48g/l,KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費した培養液を種培養液とした。Tween40添加培養においては、種培養液2mlを20mlのフラスコ培地(グルコース80g/l,硫酸アンモニウム 30g/l,KH_(2)PO_(4) 1g/l,MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l,FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l,MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l,VB1 200μg/l,Biotin 60μg/l,大豆加水分解物(T-N)0.48g/l,KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。培養開始後、OD620(x101)=0.2に到達した時点で、最終濃度5g/LとなるようにTween40を添加し培養を継続した。ビオチン制限培養においては、種培養液1mlを20mlのフラスコ培地(グルコース80g/l,硫酸アンモニウム 30g/l,KH_(2)PO_(4) 1g/l,MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l,FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l,MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l,VB1 200μg/l,大豆加水分解物(T-N)0.48g/l,KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。この条件ではビオチンの終濃度が約2.9μg/Lとなる。
Tween40添加培養およびビオチン制限培養ともに、培養開始後40時間後の培地中のL-グルタミン酸濃度を測定した。結果を表9に示す(OD620は101倍希釈の菌体量、Glu(g/L)はL-グルタミン酸の蓄積量を示す)。ATCC13869-19株では、L-グルタミン酸生産条件でもL-グルタミン酸の蓄積の増大が認められた。
【0126】
【表9】

【0127】
ATCC13869株、ATCC13869-L30、ATCC13869-A1株、ATCC13869-19株、プラスミドによるyggB増幅株についても、Tween40添加培養を行なった。CM-Dexプレートに一夜培養した菌体を1/6プレート分かきとり、20mlのフラスコ培地(グルコース80g/l,硫酸アンモニウム 30g/l,KH_(2)PO_(4) 1g/l,MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l,FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l,MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l,VB1 200μg/l,Biotin 60μg/l,大豆加水分解物(T-N)0.48g/l,KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。培養開始5時間後にTween40を終濃度1g/Lとなるように添加し、培養開始から24時間後の菌体量とL-グルタミン酸の収量を分析した。その結果、表10に示すように、ATCC13869-19,ATCC13869-L30,ATCC13869-A1株、野生型のyggB遺伝子増幅株(ATCC13869/pL5k-1)ともにL-グルタミン酸生産条件でのL-グルタミン酸の収量が向上していることが示された。
【0128】
【表10】

【実施例11】
【0129】
<8型YggB変異株の構築>
8型変異は、配列番号61の837位のGがAに置換された変異であり、配列番号62の111位のアラニンがスレオニンに置換されている。この変異が導入された変異型YggB遺伝子の塩基配列を配列番号63に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号64に示す。
実施例7と同様の方法にて、8型変異が導入されたyggB変異株を構築する。具体的には、配列番号30に示す合成DNAと配列番号65に示す合成DNAをプライマーとして、Brevibacterium flavumATCC14067株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製する。同様に配列番号34と配列番号66の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号9と配列番号34の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、8型YggB遺伝子の部分断片を取得する。得られた変異型YggB断片はSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドを構築する。このようにして得られたpBS4 YggB8を実施例6記載の方法と同様にATCC14067株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、8型に置換されていた株を選択し、8型変異を有する株を構築する。このような変異を持つ8型変異株をATCC14067yggB8株とする。
【実施例12】
【0130】
<66型YggB変異株の構築>
66型変異は、配列番号67の1673番目のCがTに置換された変異であり、配列番号68の424番目のプロリンがロイシンに置換されている。この変異が導入された変異型YggB遺伝子の塩基配列を配列番号69に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号70に示す。
実施例7と同様の方法にて、66型変異が導入されたyggB変異株を構築する。具体的には、配列番号30に示す合成DNAと配列番号71に示す合成DNAをプライマーとして、C.melassecolaATCC17965株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製した。同様に配列番号34と配列番号72の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号9と配列番号10の合成DNAをプライマーとしてPCRを行えば66型yggB遺伝子の部分断片を取得できる。得られた変異型YggB断片をSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドを構築する。このようにして得られたpBS4 YggB66を実施例6記載の方法と同様にATCC17965株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、66型に置換されていた株を選択することで、66型変異を有する株を構築できる。このような変異を持つ66型変異株をyggB66株とする。
【実施例13】
【0131】
<in vitro変異による変異型yggB遺伝子のスクリーニング>
(13-1)yggB欠損株の構築
変異型のyggB遺伝子をin vitroでyggBに変異をランダムに導入し、その中から界面活性剤等の添加なしにグルタミン酸生産が可能となるクローンを選択することも出来る。変異型遺伝子のスクリーニングを行うため、まずyggB欠損株を構築した。配列番号39に示す合成DNAと配列番号40に示す合成DNAをプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製した。同様に配列番号41と配列番号42の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製した。配列番号40と41は互いに相補的である。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号39と配列番号42の合成DNAをプライマーとしてPCRを行ないyggB遺伝子のORFを欠失した断片を取得した。
【0132】
得られたPCR断片はSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、欠損変異導入用のプラスミドを構築した。このようにして得られたpBS4ΔYggBを実施例6記載の方法でATCC13869株の染色体に挿入した後、脱落させた。得られたカナマイシン感受性株の染色体DNAを鋳型として、配列番号39と配列番号42の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、yggB遺伝子が欠損していることを確認した。得られたyggB遺伝子欠損株をATCC13869ΔyggB株とした。
【0133】
(13-2)変異型yggB遺伝子のin vitroスクリーニング
一方、yggB遺伝子の変異処理は以下のようにして行った。まず、プラスミドpL5kはyggB遺伝子以外の領域を若干含んでいるため、pL5kをXhoIとSalIで処理し、セルフライゲーションすることにより、プラスミドpL5kXSを得た。なおSalI認識部位は、配列番号5の塩基配列上には存在しないが、pBS3のマルチクローニングサイトに存在している。得られたpL5kXS約10μgを500mMリン酸緩衝液、400mMヒドロキシルアミン、1mM EDTA(pH6.0)に溶解し、75℃で30分から90分処理することにより変異を導入した。変異導入後のプラスミドは、SUPREC-02(タカラバイオ)で脱塩した後、実施例6記載の方法でATCC13869ΔyggB株に導入し、Km25μg/mlを含むCM2B培地で形質転換体を選択した。また、対照として変異処理前のpL5kXSについてもATCC13869ΔyggB株に導入した。出現した形質転換体を、CM2BGU2培地(実施例3記載のCM2B培地にグルコース10g/Lと15g/LのUreaを含む)2mlの液体培地に接種し、31.5℃で5時間しんとう培養したのち、グルタミン酸濃度を定量した。
表11に、ATCC13869ΔyggBを変異処理したpL5kXSで形質転換した株をCM2BGU2培地にて試験管培養評価した結果を示す。変異処理時間60分と90分のプラスミド混合物から得られた形質転換体の中には、1g/L以上のL-グルタミン酸を蓄積するクローンが3クローンが存在していた。なお、培地中にもともと含まれていたグルタミン酸は0.16g/Lであり、ATCC13869ΔyggB/pL5kXS(変異処理なし)
のグルタミン酸畜積量は0.31g/Lであった。
表12に、ATCC13869ΔyggBを変異処理したpL5kXSで形質転換した株をCM2BGU培地(Ureaが1.5g/Lである以外はCM2BGU2培地と同組成)にて試験管培養評価した結果を示す。変異処理時間90分のプラスミド混合物から得られた形質転換体の中に、1g/L以上のL-グルタミン酸を蓄積するクローンが1クローン存在していた。
【0134】
【表11】

【0135】
【表12】

【0136】
表11において、60分の変異処理時間を行うことで1g/L以上のL-グルタミン酸を蓄積する生産能を獲得したプラスミドをpL5kXSm-22,表12において、90分の変異処理時間を行うことで0.9g/L以上のL-グルタミン酸生産能を獲得したプラスミドをpL5kXSm-27とした。ATCC13869ΔyggB/pL5kXS株、ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-27株、ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-22株を、実施例2記載の条件で培養し、4時間後の菌体量とL-グルタミン酸蓄積を分析した。表13に、独立した3回の実験による平均値を示した。ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-27株、ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-22株では有意にL-グルタミン酸蓄積が上昇していることが確認でき、in vitroでのランダムな変異導入によってもL-グルタミン酸に有利な変異型遺伝子が構築可能であることが示された。なお、pL5kXSm-22が含むyggB遺伝子の配列は、配列番号73に示した。(22型変異)
22型変異は、437番目のプロリンをセリンに置換する変異であり、例えば配列番号5の2745位のCをTに置換する変異である。また、本変異は、3060位のCをTに置換する変異を伴っている。この変異型yggB遺伝子を配列番号73に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号74に示す。
【0137】
【表13】

【0138】
(13-3)変異型遺伝子のコリネ型細菌への導入とL-グルタミン酸生産確認
(13-2)で得られた新規変異型yggB遺伝子をコリネ型細菌に導入する。導入方法は、実施例6に記載された方法でpBS4Sに変異型遺伝子を導入し、ATCC13869の染色体上の野生型のyggB遺伝子と置換した。この新規変異型遺伝子を導入した株と親株のATCC13869株を実施例2と同様の方法で培養を行う。培養終了後、培養液中に含まれるL-グルタミン酸の量を公知の方法で測定し、変異導入株がL-グルタミン酸の蓄積が向上していることを確認する。このような方法でL-グルタミン酸生産能の向上したyggB変異株を取得することが出来る。
【実施例14】
【0139】
<変異型yggB遺伝子保持株のグルタミン酸アナログ感受性>
(14-1)固体培地における4-フルオログルタミン酸感受性
yggB変異によってL-グルタミン酸の生産能が向上している株では、L-グルタミン酸アナログ感受性が低下していることが予測された。そこで、yggB変異によるL-グルタミン酸のアナログとして、4-フルオログルタミン酸に対する感受性の変化を検討した。実施例4記載の最少培地に、NaOHでpH6.7に調整しフィルター滅菌した4-フルオログルタミン酸を終濃度7.5mMとなるように添加した。ATCC13869株、ATCC13869-L30株、ATCC13869-A1株をCM-Dex培地に塗布して一夜培養した後集菌し、滅菌した0.85%のNaCl溶液で洗浄し、図6上部に記載の菌濃度となるように希釈してプレートにスポットした。プレートは31.5℃で培養し、その経時変化を図6に示した。4-フルオログルタミン酸を無添加の条件では、ATCC13869株が最も生育が速いのに対し、4-フルオログルタミン酸添加条件ではATCC13869株の生育が抑えられ、ATCC13869-L株およびATCC13869-A1株の方が生育が良好であることが示された。
【0140】
(14-2)液体培地における4-フルオログルタミン酸感受性
実施例4記載の最少培地(ただし寒天を含まない)に、NaOHでpH6.7に調整しフィルター滅菌した4-フルオログルタミン酸を終濃度1.25mM,2.5mM,5mM,10mM,20mMとなるように添加した。ATCC13869株、ATCC13869ΔyggB株、ATCC13869-L30株、ATCC13869-A1株をCM-Dex培地に塗布して31.5℃で一夜培養した後集菌し、滅菌した0.85%のNaCl溶液で洗浄し、液体培地に接種し31.5℃にて振とう培養した。各菌株において、4-フルオログルタミン酸を無添加の培地でのOD660の値が1に到達した時点で培養を終了し、培養液を適当に希釈してCM-Dexプレートに塗布した。翌日出現したコロニー数を計測し、液体培養終了時の生菌数とした。4-フルオログルタミン酸無添加区の生菌数を1として、4-フルオログルタミン酸添加による相対生菌数の変化を図7に示した。ATCC13869-A1株およびATCC13869-L30株では、4-フルオログルタミン酸に対する感受性が低下(4フルオログルタミン酸耐性が向上)していることが明らかとなった。
これらの結果から、4-フルオログルタミン酸等、グルタミン酸の構造類縁体の感受性を指標としたスクリーニングによっても本発明のyggB変異株が取得できることが示された。
【実施例15】
【0141】
<odhA弱化株での変異型yggB遺伝子導入株の作成と評価>
【0142】
上記実施例9で構築したATCC13869-L30株を用いてyggB odhA二重変異株を構築し、変異型odhA遺伝子の評価を行った。
まず、ATCC13869-L株のodhA遺伝子に表14に示す変異を導入した株を構築した。なお、表14では、配列番号43の塩基番号2528?2562に相当する領域の配列を示した。また、表15では配列番号44のアミノ酸番号696?707に相当する領域の配列を示した。
配列番号45の塩基配列を有する変異型odhA遺伝子が導入されたL30sucA8株を構築するには以下のようにすればよい。まず配列番号53と配列番号54に示す合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、odhA断片を調整する。得られたodhA断片をBamHI処理して、タカラバイオ製Mutan-Super Express Kmに付属のプラスミドpKF19mのBamHI部位にクローニングした後、5’末端がリン酸化された配列番号55の合成DNAとMutan-Super Express Kmに添付されているセレクションプライマーを用いてPCRを行い、得られたPCR産物でsup0のE.coli例えばMV1184株を形質転換することで変異型odhA断片を含むプラスミドを構築する。次にこの断片をBamHIで切り出し、pBS4SのBamHI部位に挿入することで変異導入用プラスミドが構築できる。このプラスミドを用いて実施例1記載の方法と同様にしてATCC13869-L株を形質転換し、染色体に変異導入用プラスミドが挿入された株を取得する。次に、これらの染色体にプラスミドが挿入された株から、スクロースに耐性を示し、かつカナマイシンに感受性を示す株を分離する。さらにodhA遺伝子の配列を確認し、目的フレームシフトが導入された株を選択することによりodhA遺伝子が欠損したL30sucA8(odhA8)株が構築できる。
【0143】
また、以下の方法でyggB変異株を用いて、他のodhA変異株を得ることができる。
配列番号47の塩基配列を有する変異型odhA遺伝子が導入されたL30sucA801株の取得には、5’末端がリン酸化された配列番号55の合成DNAの代わりに5’末端がリン酸化された配列番号56の合成DNAを用いて上記方法を適用すればよい。
配列番号49の塩基配列を有する変異型odhA遺伝子が導入されたL30sucA805株の取得には、5’末端がリン酸化された配列番号55の合成DNAの代わりに5’末端がリン酸化された配列番号57の合成DNAを用いて上記方法を適用すればよい。
配列番号51の塩基配列を有する変異型odhA遺伝子が導入されたL30sucA77株の取得には、5’末端がリン酸化された配列番号55の合成DNAの代わりに5’末端がリン酸化された配列番号58の合成DNAを用いて上記方法を適用すればよい。
L30sucA8株のodhA遺伝子はフレームシフト変異であるために、αKGDH活性を有さない。しかし、L30sucA801株、L30sucA805株、L30sucA77株はodhA遺伝子に欠失があるものの、フレームシフトが起こらない変異となっており、αKGDH活性を有しているが活性は非改変株より低下している。(データは示さず)
【0144】
【表14】

【0145】
【表15】

【0146】
<odhA改変株のグルタミン酸生産培養>
これらのodhA改変株のL-グルタミン酸生産能を、坂口フラスコを用いた培養を行うことにより検証した。表14に示した株をCM-Dex寒天培地で31.5℃で一昼夜培養を行い、フラスコ培地(グルコース60g/l、硫安22.5g/l、KH_(2)PO_(4) 1g/l、MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l、FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l、MnSO_(4)・4-5H_(2)O 0.01g/l、ビタミンB1 200μg/l、大豆蛋白加水分解液0.48g/l、ビオチン300μg/l、KOHを用いてpH8.0に調整)20mlに1/6プレート分の菌体を接種し、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウム1gを添加した後、31.5℃、速度115rpmで振とう培養を行った。培養開始19時間目のL-グルタミン酸蓄積を表16に示した。odhA改変株の中には、ATCC13869-L株とほぼ同等のL-グルタミン酸蓄積のものも含まれていたが、sucA801,sucA805,sucA77株はsucA8株よりも高いグルタミン酸蓄積を示した。これらの結果から、yggB遺伝子の変異と共にodhA遺伝子に変異を導入することによって、さらにL-グルタミン酸収率が向上することを見出した。
【0147】
【表16】

【実施例16】
【0148】
<ATCC14067株およびATCC14067yggB8からのodhA弱化株の構築>
8型変異を有するyggB変異株よりodhA欠損株を構築し、odhA欠損のみを有する株と比較培養を行なった。まず、odhAを完全欠損するためのプラスミドを構築した。ATCC14067株の染色体DNAを鋳型として、配列番号77と配列番号78の合成DNAを用いてPCRを行い、sucA遺伝子の上流側断片を調製した。続けて、ATCC14067株の染色体DNAを鋳型として、配列番号79と配列番号80の合成DNAを用いてPCRを行い、sucA遺伝子の下流側断片を調製した。次に、上流側断片と下流側断片を等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号81と配列番号82の合成DNAを用いてPCRを行い、odhAを欠失した遺伝子断片を調製した。得られたPCR断片をBamHIで処理した後、実施例1で構築したpBS4Sにクローニングした。こうして得られるプラスミドをpBSΔsucA47とした。
pBSΔsucA47を実施例6記載の方法と同様にATCC14067株またはATCC14067yggB8株の染色体に挿入した後、脱落させた。得られたカナマイシン感受性株より染色体DNAを調製し、これを鋳型として配列番号77および配列番号80の合成DNAを用いてPCRを行い、odhA領域が欠損している株を選択した。こうして構築したodhA欠損株をそれぞれATCC14067ΔodhA株およびATCC14067ΔodhA yggB8株とした。
構築したATCC14067ΔodhA株およびATCC14067ΔodhA yggB8株を実施例3記載の方法で培養した結果を表17に示した。yggB8変異によってodhA変異株のL-グルタミン酸収量を向上できることが明らかとなった。
【0149】
【表17】

【実施例17】
【0150】
<2A-1R株からのsymA欠損株の構築>
実施例3で構築した、yggBにIS挿入変異を有する2A-1R株より、symA(suppressor of ygg mutation A)遺伝子を欠損した株を構築し、2A-1R株と比較培養を行なった。ATCC13869株のNCgl1867遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列はそれぞれ配列番号86および87に記した。まず、symA遺伝子を完全欠損するためのプラスミドを構築した。ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、配列番号88と配列番号89の合成DNAを用いてPCRを行い、symA遺伝子の上流側断片を調製した。続けて、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、配列番号90と配列番号91の合成DNAを用いてPCRを行い、symA遺伝子の下流側断片を調製した。次に、上流側断片と下流側断片を等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号88と配列番号91の合成DNAを用いてPCRを行い、symA遺伝子を欠失した遺伝子断片を調製した。得られたPCR断片をBglIIで処理した後、実施例1で構築したpBS4Sにクローニングした。こうして得られるプラスミドをpBSΔsymAとした。
pBSΔsymAを実施例6記載の方法と同様に2A-1R株の染色体に挿入した後、脱落させた。得られたカナマイシン感受性株より染色体DNAを調製し、これを鋳型として配列番号88および配列番号91の合成DNAを用いてPCRを行い、symA領域が欠損している株を選択した。こうして構築したsymA欠損株を2A-1RΔsymA株とした。
構築した2A-1RΔsymA株および親株の2A-1R株を実施例3記載の方法で培養した結果を表18に示した。symA遺伝子の欠損によって、変異型yggB遺伝子を有する株のグルタミン酸生産能を向上できることが明らかとなった。
【0151】
【表18】

【実施例18】
【0152】
<野生型yggB遺伝子増強株の構築>
コリネ型細菌の野生型yggB遺伝子を含むプラスミドにはpL5kを用いた。pL5kは、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869株の染色体DNAをSau3AIで部分分解して得られたDNA断片を、pVK9のBamHI部位に挿入して得たプラスミドである。pVK9のBamHI部位に挿入されているDNA配列を配列番号5に、yggB遺伝子のコード領域を配列番号5の塩基番号1437-3035番目に示す。なお、pVK9は、pHSG299(タカラバイオ)のAvaII部位を平滑末端化し、pHK4(特開平05-007491)に含まれるコリネ型細菌内で自律複製可能な領域をBamHIおよびKpnIで切り出し平滑末端化した断片を挿入したシャトルベクターである。pL5kと同様の構成のプラスミドは、配列番号59と配列番号60の合成DNAをプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、得られた増幅産物をBamHIで処理してpVK9のBamHI部位に挿入することによっても構築できる。
【0153】
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869株をpL5kで、電気パルス法(特開平2-207791)にて形質転換した。形質転換後の菌体はカナマイシン25μg/mlを含むCM2Bプレート培地(ポリペプトン10g/l、酵母エキス10g/l、NaCl 5g/l、寒天20g/l、KOHを用いてpH7.0に調整)に塗布し、31.5℃で一晩培養した。翌日出現したコロニーをカナマイシン25μg/mlを含むCM2Bプレート培地で純化し、YggB増幅株を得た。定法によりこれらの形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のプラスミドが導入されていることを確認した。こうして得られたYggB増幅株をATCC13869/pL5kとした。また対照株として、pVK9が導入された株ATCC13869/pVK9を上記と同様の方法で構築した。
【実施例19】
【0154】
<野生型yggB遺伝子増強株の評価>
(2-1)ビオチン制限培養での効果確認
実施例18で構築した野生型yggB遺伝子増強株および対照株をそれぞれ3クローン選択し、20mlの種培養培地(グルコース80g/l,硫酸アンモニウム 30g/l,KH_(2)PO_(4) 1g/l,MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l,FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l,MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l,VB1 200μg/l,Biotin 60μg/l,大豆加水分解物(T-N)0.48g/l,KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費したのち、培養液2mlを、ビオチンを含まない20mlの主培養培地(グルコース80g/l,硫酸アンモニウム 30g/l,KH_(2)PO_(4) 1g/l,MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l,FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l,MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l,VB1 200μg/l,大豆加水分解物(T-N)0.48g/l,KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。糖を完全に消費したのち、培地中のグルタミン酸濃度を測定した。その結果、ベクター導入株に比しyggB増強株(ATCC13869/pL5k)ではグルタミン酸の培地中の蓄積が向上していることが示された。(表19 OD620は菌体量、GH(g/L)はグルタミン酸生産量を示す)
【0155】
【表19】

【0156】
(2-2)界面活性剤添加条件での効果確認
実施例18で構築した野生型YggB増強株および対照株をそれぞれ3クローン選択し、20mlの種培養培地(グルコース80g/l,硫酸アンモニウム 30g/l,KH_(2)PO_(4) 1g/l,MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l,FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l,MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l,VB1 200μg/l,Biotin 60μg/l,大豆加水分解物(T-N)0.48g/l,KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費したのち、培養液2mlを、20mlの主培養培地(グルコース80g/l,硫酸アンモニウム 30g/l,KH_(2)PO_(4) 1g/l,MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l,FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l,MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l,VB1 200μg/l,Biotin 60μg/l,大豆加水分解物(T-N)0.48g/l,KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。培養開始後2時間後
に、Tween40を終濃度5g/Lとなるように添加し、培養を継続した。糖を完全に消費したのち、培地中のグルタミン酸濃度を測定した。その結果、ベクター導入株に比し野生型YggB増強株(ATCC13869/pL5k)ではL-グルタミン酸の培地中の蓄積が向上していることが示された。(表20 OD620は菌体量、GHはL-グルタミン酸生産量を示す。)
【0157】
【表20】

【0158】
(2-3)ペニシリンG添加培養での効果確認
実施例18で構築した野生型yggB遺伝子増強株および対照株をそれぞれ3クローン選択し、20mlの種培養培地(グルコース80g/l,硫酸アンモニウム 30g/l,KH_(2)PO_(4) 1g/l,MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l,FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l,MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l,VB1 200μg/l,Biotin 60μg/l,大豆加水分解物(T-N)0.48g/l,KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費したのち、培養液2mlを、20mlの主培養培地(グルコース80g/l,硫酸アンモニウム 30g/l,KH_(2)PO_(4) 1g/l,MgSO_(4)・7H_(2)O 0.4g/l,FeSO_(4)・7H_(2)O 0.01g/l,MnSO_(4)・4?5H_(2)O 0.01g/l,VB1 200μg/l,Biotin 60μg/l,大豆加水分解物(T-N)0.48g/l,KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。培養開始後2時間後に、ペニシリンGを終濃度0.5U/mlとなるように添加し、培養を継続した。糖を完全に消費したのち、培地中のL-グルタミン酸濃度を測定した。その結果、ベクター導入株に比しYggB導入株(ATCC13869/pL5k)ではL-グルタミン酸の蓄積が向上していることが示された。(表21)
【0159】
【表21】

【図面の簡単な説明】
【0160】
【図1】プラスミドpBS3の構築手順を示す図。
【図2】プラスミドpBS4Sの構築手順を示す図。
【図3】プラスミドpBS4sucAintの構築手順を示す図。
【図4】yggB変異導入株のL-グルタミン酸蓄積を示す図。
【図5】2A-1型変異yggB遺伝子の変異導入箇所を示す図。
【図6】変異型yggB遺伝子導入株の4-フルオログルタミン酸含有CM-Dexプレート培地における生育を示す図(写真)。
【図7】変異型yggB遺伝子導入株の4-フルオログルタミン酸(4-FG)含有液体培地における生育を示す図。
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
L-グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、
変異型yggB遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してL-グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって、
前記変異型yggB遺伝子は、(i)、(i’)、(i’’)または(ii)の変異が導入された、コリネ型細菌:
(i)配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸配列のアミノ酸番号419-533の領域もしくは配列番号62のアミノ酸番号419-529の領域の欠失、
(i’)配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸配列のアミノ酸番号419-533の領域もしくは配列番号62のアミノ酸番号419-529の領域へのインサーションシーケンス又はトランスポゾンの挿入、
(i’’)配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸配列のアミノ酸番号419-533の領域もしくは配列番号62のアミノ酸番号419-529の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異、
または
(ii)配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列のアミノ酸番号1-23、86-108、及び110-132からなる群から選ばれる領域における1?5個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入。
【請求項2】
前記(i’’)の変異は、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、424位のプロリンをアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなる群から選ばれる1個のアミノ酸に置換し、及び/または437位のプロリンをスレオニン、セリン及びチロシンからなる群から選ばれる1個のアミノ酸に置換する変異である、請求項1に記載のコリネ型細菌。
【請求項3】(削除)
【請求項4】
L-グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、
変異型yggB遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してL-グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって、
前記変異型yggB遺伝子の変異は、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、100位のアラニンをスレオニンに、及び/または111位のアラニンをスレオニンもしくはバリンに置換する変異である、コリネ型細菌。
【請求項5】
L-グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、
変異型yggB遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してL-グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって、
前記変異型yggB遺伝子の変異は、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、14位のロイシンと15位のトリプトファンの間に1?5アミノ酸を挿入する変異である、コリネ型細菌。
【請求項6】
前記変異型yggB遺伝子が、下記(a)?(n)より選ばれる変異型yggB遺伝子である請求項1、2、4及び5のいずれか一項に記載のコリネ型細菌:
(a)配列番号8のアミノ酸配列をコードするDNA、
(b)配列番号8のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(c)配列番号20のアミノ酸配列をコードするDNA、
(d)配列番号20のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(e)配列番号22のアミノ酸配列をコードするDNA、
(f)配列番号22のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(g)配列番号24のアミノ酸配列をコードするDNA、
(h)配列番号24のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(i)配列番号64のアミノ酸配列をコードするDNA、
(j)配列番号64のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(k)配列番号70のアミノ酸配列をコードするDNA、
(l)配列番号70のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(m)配列番号74のアミノ酸配列をコードするDNA、
(n)配列番号74のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
【請求項7】
前記変異型yggB遺伝子の導入により、L-グルタミン酸アナログ耐性が向上したことを特徴とする、請求項1、2及び4?6のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項8】
さらに(i)のsymA遺伝子が不活化するように改変された、請求項1、2及び4?7のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
(i)配列番号86の塩基番号585?1121の塩基配列を含むDNA。
【請求項9】
さらにα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された、請求項1、2及び4?8のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項10】
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する、請求項1、2及び4?9のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項11】
請求項1、2及び4?10のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を培地で培養し、L-グルタミン酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地からL-グルタミン酸を回収することを特徴とするL-グルタミン酸の製造法。
【請求項12】
下記(a)?(n)より選ばれる変異型yggB遺伝子:
(a)配列番号8のアミノ酸配列をコードするDNA、
(b)配列番号8のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(c)配列番号20のアミノ酸配列をコードするDNA、
(d)配列番号20のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(e)配列番号22のアミノ酸配列をコードするDNA、
(f)配列番号22のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(g)配列番号24のアミノ酸配列をコードするDNA、
(h)配列番号24のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(i)配列番号64のアミノ酸配列をコードするDNA、
(j)配列番号64のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(k)配列番号70のアミノ酸配列をコードするDNA、
(l)配列番号70のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(m)配列番号74のアミノ酸配列をコードするDNA、
(n)配列番号74のアミノ酸配列において、1?5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
 
訂正の要旨 審決(決定)の【理由】欄参照。
審理終結日 2018-12-21 
結審通知日 2018-12-26 
審決日 2019-01-08 
出願番号 特願2005-379259(P2005-379259)
審決分類 P 1 113・ 536- YAA (C12N)
P 1 113・ 537- YAA (C12N)
P 1 113・ 121- YAA (C12N)
最終処分 不成立  
前審関与審査官 小倉 梢  
特許庁審判長 中島 庸子
特許庁審判官 高堀 栄二
松浦 安紀子
登録日 2013-08-23 
登録番号 特許第5343303号(P5343303)
発明の名称 L-グルタミン酸生産菌及びL-グルタミン酸の製造方法  
代理人 山本 修  
代理人 鶴喰 寿孝  
代理人 森▲崎▼ 博之  
代理人 白石 真琴  
代理人 中野 亮介  
代理人 森▲崎▼ 博之  
代理人 西川 喜裕  
代理人 飯村 敏明  
代理人 西川 喜裕  
代理人 白石 真琴  
代理人 鶴喰 寿孝  
代理人 中野 亮介  
代理人 山本 修  
代理人 飯村 敏明  
代理人 末吉 剛  
代理人 末吉 剛  
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