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審決分類 審判 訂正 ただし書き1号特許請求の範囲の減縮 訂正する C07K
管理番号 1052309
審判番号 訂正2001-39077  
総通号数 27 
発行国 日本国特許庁(JP) 
公報種別 特許審決公報 
発行日 1992-03-23 
種別 訂正の審決 
審判請求日 2001-05-21 
確定日 2001-08-27 
訂正明細書 有 
事件の表示 特許第2963163号に関する訂正審判事件について、次のとおり審決する。 
結論 特許第2963163号発明の明細書を本件審判請求書に添付された訂正明細書のとおり訂正することを認める。 
理由 I.請求の要旨
本件審判の請求の要旨は、特許第2963163号発明(平成2年7月27日特許出願、平成11年8月6日設定登録)の明細書を審判請求書に添付した訂正明細書のとおり、すなわち、下記のとおり訂正することを求めるものである。

「【請求項1】下記アミノ酸配列(配列中、Xaaはピログルタミン酸を表わす。)で表わされるヒト肝実質細胞増殖因子。
(アミノ酸配列は略)」を
「【請求項1】CHO細胞が産生する組み換え蛋白質であることを特徴とする、下記アミノ酸配列(配列中、Xaaはピログルタミン酸を表わす。)で表わされる生物学的活性を有するヒト肝実質細胞増殖因子。
(アミノ酸配列は略)」に訂正する。

II.当審の判断
1.訂正の目的の適否並びに新規事項及び拡張・変更の存否
上記訂正事項は、訂正前の請求項1に記載の「ヒト肝実質細胞増殖因子」を「CHO細胞が産生する組み換え蛋白質」であって「生物学的活性を有する」ヒト肝実質細胞増殖因子に限定したものであり、特許請求の範囲の減縮に相当するものである。

上記訂正事項「CHO細胞が産生する組み換え蛋白質である」は、本件特許公報第9頁右欄第47行目〜第10頁左欄第15行目の記載(特には、第10頁左欄第7〜10行目における「動物細胞例えばCHO細胞、COS細胞、マウスL細胞、マウスC127細胞、マウスFM3A細胞等を用いて上記遺伝子を発現させることが望ましい」という記載)、並びに本件特許公報第11頁右欄第45行目から第12頁左欄第2行目の記載(本件明細書の実施例では、CHO細胞を宿主細胞として用いて形質転換を行ったことが記載されている)により裏付けられているものである。
さらに、上記訂正事項「生物学的活性を有する」は、本件特許公報第9頁右欄第48〜50行目における「さらに発現したhHGF蛋白質が生物学的活性すなわち肝実質細胞の増殖活性を有している必要がある。」という記載、並びに本件特許公報第12頁右欄第2〜5行目及び第13頁左欄第18〜21行目における「また、Gohdaらの方法(エクスペリメンタル・セル・リサーチ(Experimental Cell Research)166巻139頁〜150頁(1986))によりhHGF活性を測定し生物学的活性の存在を確認した。」という記載により裏付けられているものである。
したがって、上記訂正事項はいずれも、願書に最初に添付した明細書に記載した事項の範囲内の訂正であって、かつ、実質上特許請求の範囲を拡張し又は変更するものではない。

2.独立特許要件の判断
2-1.特許法第29条第1項第3号
特開昭63-22526号公報(以下「引用刊行物A」という。)には、ヒト血液、殊に劇症肝炎患者の血漿から活性な肝細胞増殖因子を単離したことが記載されている。
ここで、訂正後の発明(以下「本件発明」という。)に係る「ヒト肝実質細胞増殖因子」が「CHO細胞が産生する組み換え蛋白質であることを特徴とする」のに対して、引用刊行物Aに記載されたものは、劇症肝炎患者の血漿から単離されたヒト由来の天然蛋白質である。そして、本件特許公報にも「このhHGF蛋白質はシグナル様ペプチド配列から数え、494個のアミノ酸からなるH鎖ペプチドと234個のアミノ酸からなるL鎖べプチドより構成される蛋白質で少なくとも4箇所に糠鎖結合部位を持つことを特徴とする。」(第9頁左欄第36〜39行目)と記載されているように、肝実質細胞増殖因子(HGF)蛋白質は糖鎖を有する糖蛋白質である。
一般に、糖蛋白質をコードするDNAを動物細胞に形質転換して得られる形質転換体を用いて組み換え蛋白質を産生する場合、産生される組み換え蛋白質は宿主の種類に応じて異なる糖鎖の修飾を受けることは当業者には周知であり、ヒト由来の天然の蛋白質とCHO細胞が発現する組み換え蛋白質との間では、付加されている糖鎖の構造(糖鎖自体の構造のみならず、糖鎖が付加する程度や、糖鎖が付加する位置等)は異なっているというのが当該技術分野の技術常識である。
したがって、本件発明に係る「CHO細胞が産生する組み換え蛋白質」と、引用刊行物Aに記載されたヒト由来の天然蛋白質が同一であるとはいえない。

2-2.特許法第29条第2項
Biochemical and Biophysical Research Communication, Vol.163, No.2, p.967-973 (1989)(以下「引用刊行物B」という。)には、劇症肝炎患者から得られた728アミノ酸からなるヒト肝細胞増殖因子(hHGF)をコードしたcDNA配列及びそれに対応するアミノ酸配列が記載されており(第970頁Fig1)、さらに、推定上のメチオニンからの最初の30個位までのアミノ酸残基は、他の分泌蛋白質のN-末端に存在するシグナルペプチドの特徴的な構成を示していること(第969頁30〜34行)、及び恐らくブロックされているために、重鎖のN-末端アミノ酸の配列が検出されなかったこと(第971頁12〜13行)が記載されている。

そこで、訂正後の発明(以下「本件発明」という。)と、引用刊行物Bに記載されたものを比較すると、本件発明は697個のアミノ酸配列(N末端はピログルタミン酸)からなる「生物学的活性を有するヒト肝実質細胞増殖因子」であるのに対して、引用刊行物Bには728個のアミノ酸配列からなるN末端にシグナル配列を含むヒト肝細胞増殖因子(hHGF)をコードしたcDNA配列及び当該cDNA配列に対応するアミノ酸配列であって、実際にはhHGF蛋白質は得られていない点で相違する。
ところで、平成13年7月4日付け訂正拒絶理由通知書で指摘したように、「CHO細胞」を用いてヒト由来の遺伝子を発現させて組み換え蛋白質を得ることは当該技術分野の常套手段であって、引用刊行物Bに記載されたcDNA配列で形質転換されたCHO細胞を用いればシグナル配列が切断された状態で分泌されるから、当該cDNA配列のうちシグナル配列に対応する部分がどこであるかを決定するまでもなく、シグナル配列の切断された成熟型の「生物学的活性を有する」組み換えhHGFは当業者であれば容易に取得できるものと一般的には考えられる。

しかしながら、平成13年7月13日付け意見書で請求人も説明するように、(1)hHGFcDNAが2.3kbと巨大であるためにhHGFを高効率に発現できるべクターを構築するためには種々の工夫と試行錯誤が必要であり、(2)発現ベクターによりCHO細胞を形質転換する際には多重トランスフェクション法を採用して初めて、hHGF活性の確認や構造の決定を行うのに十分な量の組み換えHGFを取得することが可能になっている。
さらに、成熟HGFは、HGF全長cDNAから読まれた728アミノ酸の全長前駆体から、シグナル配列が除去された697アミノ酸の1本鎖の前駆体蛋白質が作られ、これがプロテアーゼで切断されて2本鎖の成熟HGFとなったものであるが、当該プロテアーゼはウシ血清中に含まれるものであって、無血清培地ではHGF活性体を得ることができない。即ち、CHO細胞を通常の培地(イーグルMEM培地やダルベッコMEM培地など)で通常の培養プロトコールで培養することによっては、生物学的活性を有するHGFはその活性を確認することができる程度の量で取得することはできず、本件発明においてERDF培地を用いているとおり、「生物学的活性を有する」HGF(2本鎖の成熟型HGF)を取得するためには、(3)培地の選定並びに適切な培養プロトコールの設定も必要である。

以上述べたように、引用刊行物Bに記載されたヒト肝細胞増殖因子(hHGF)をコードしたcDNA配列を発現させて、活性の確認や構造の決定を行うのに十分な量の「生物学的活性を有するヒト肝実質細胞増殖因子」を取得するためには、(1)発現べクターの構築、(2)多重トランスフェクション法の採用、(3)培地の選定等を適切に組み合わせて行う必要があり、このような事柄は、当業者が容易になし得るものとは認められない。

よって、訂正後の発明は、引用例Aに記載された発明とは言えず、引用例Bに記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとも認められないから、本件発明は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものと認められる。

III.むすび
以上のとおりであるから、本件審判の請求は、平成6年法律第116号附則第6条第1項の規定によりなお従前の例によるとされる平成5年法律第26号により改正された特許法第126条第1項第1号に掲げる事項を目的とし、かつ、同条第1項ないし第3項の規定に適合する。
よって、結論のとおり審決する。
 
発明の名称 (54)【発明の名称】
ヒト肝実質細胞増殖因子
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】 CHO細胞が産生する組み換え蛋白質であることを特徴とする、下記アミノ酸配列(配列中、Xaaはピログルタミン酸を表わす。)で表わされる生物学的活性を有するヒト肝実質細胞増殖因子。






【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明はヒト肝実質細胞増殖因子に関する。
(従来の技術)
肝臓は、生体中唯一再生可能な臓器である。この肝再生現象は肝移植実験や体液交流実験などから何らかの液性因子によることが示唆されてきた。近年、本発明者らは肝実質細胞を生体内より取り出し生体外においてその増殖を促進させるヒト由来の蛋白性因子すなわち、ヒト肝実質細胞増殖因子(以下「hHGF」と略す。)を劇症肝炎患者血漿より見いだし(バイオメディカルリサーチ(Biomed.Res.)6巻231頁(1985)及びエクスペリメンタルセルリサーチ(Exp.Cell.Res.)166巻139頁(1986))、世界で初めて単一の蛋白質として精製することに成功した(特開昭63-22526号公報及びジャーナルオブクリニカルインベスティゲーション(J.Clin.Invest.)81巻414頁(1988))。さらにhHGF蛋白質をコードする遺伝子を単離するに至った(特許出願済(特願平1-209449号)及びバイオケミカルバイオフィジカルリサーチコミュニケーション(Biochem.Biophys.Res.Comun.)163巻967頁(1989))。
このhHGF蛋白質はシグナル様ペプチド配列から数え、494個のアミノ酸からなるH鎖ペプチドと234個のアミノ酸からなるL鎖ペプチドより構成される蛋白質で少なくとも4箇所に糖鎖結合部位を持つことを特徴とする。これら2つのペプチド鎖はジスルフィド結合(S-S結合)により結合しており、肝実質細胞の増殖を生体外に於いて促進する活性が認められている(バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション(Biochem.Biophys.Res.Comun.)163巻967頁(1989))。各ペプチド鎖の遺伝子はH鎖及びL鎖ペプチドの順に連なった形でコードされている。そのため一本のRNA上に転写され、同時に一つの蛋白質として翻訳される。その後N末端側に存在するシグナル様配列の切断除去が起こりさらにそれ以降の一本の蛋白鎖が二本に切断される。これによって生じた二本のペプチド鎖はS-S結合を介して機能的な蛋白質を形成すると考えられる。
(発明が解決しようとする問題点)
このhHGF蛋白質の生化学的ならびに生理的機能を明らかにすることは肝再生機構の解明のみならず、生体外における安定な肝実質細胞の供給ならびに肝疾患に対する治療薬の開発に重要な役割を担ってくる。しかしながらhHGF蛋白質の生体における詳細な機能、あるいは肝障害時における肝再生に対するhHGF蛋白質の効果等を調べるためには多量のhHGF蛋白質を必要とする。
ところが現在に至るまでhHGF蛋白質を取得する方法としては、劇症肝炎患者血漿を材料として、その中に微量に存在するhHGF蛋白質の精製を行わざるをえなかった。この方法は人的、時間的、価格的に必ずしも容易な方法ではなく、またウイルスなどを始めとした感染源の存在する患者血漿中から微量なhHGF蛋白質のみを安定にとりだすことは困難を極める。これらの理由から劇症肝炎患者血漿を材料としたhHGF蛋白質の安定かつ大量の精製は行われていなかった。
(問題点を解決するための手段)
そこで本発明者らは、hHGF蛋白質を組換えDNA技術により安定かつ大量に取得するため種々の検討をした結果、この目的に有用なhHGF蛋白質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを新たに構築しhHGF蛋白質の発現を可能にした(特願平2-88592号公報)。
更に、本発明者らは、上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養して得られるhHGFのアミノ酸配列について検討した結果、分泌されたhHGFのN末端アミノ酸がピログルタミン酸であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明の要旨は、第2図で表わされるアミノ酸配列を有するヒト肝実質細胞増殖因子に存する。
以下に、本発明を説明する。
HGF蛋白質の工業生産のためには、その蛋白質発現が安定した宿主-ベクター系を選択すること、さらに発現したhHGF蛋白質が生物学的活性すなわち肝実質細胞の増殖活性を有している必要がある。特に天然のhHGF蛋白質が糖蛋白質であること、またhHGF蛋白質が多くのシステイン残基を含み、そのシステイン残基間のチオール結合の位置および蛋白質の高次構造が活性維持に重要であることを考慮する必要がある。
このような場合、宿主としては酵母や大腸菌例えば、Saccharomycescerevisiae株やEscherichia coliYA-21株等の微生物も使用することが出来るが、動物細胞例えばCHO細胞、COS細胞、マウスL細胞、マウスC127細胞、マウスFM3A細胞等を用いて上記遺伝子を発現させることが望ましい。またこれらの細胞を宿主とする場合は、第1図に示すDNA配列中に含まれるシグナル様配列すなわち1〜93番目を含む未成熟のhHGF遺伝子を細胞内に導入することにより、成熟型hHGF蛋白質が細胞外に分泌生産されることが期待されるという利点が挙げられる。
本発明において用いられる発現ベクターは、そのプロモーター下流にhHGF蛋白質の一部または全部のアミノ酸配列をコードするDNA断片を有する。
プロモーターとしては、種々のプロモーターが報告されているが、本発明においては、SV40プロモーターまたはメタロチオネイン遺伝子のプロモーターが好ましい。このプロモーターの下流に前述のシグナル様配列を含む未成熟のhHGF遺伝子のDNA断片を転写方向に従って挿入する。この場合、hHGF遺伝子のDNA断片をタンデムに2-3個結合したものを挿入してもよいし、また、hHGF遺伝子のDNA断片の5′上流側にプロモーターを結合したDNA断片を単位とし、転写方向を揃えてタンデムに2-3個結合したものを挿入してもよい。
上記hHGF遺伝子には、その下流にポリアデニル化部位が存在することが必要である。例えば、SV40DNA、β-グロビン遺伝子またはメタロチオネイン遺伝子由来のポリアデニル化部位がhHGF遺伝子の下流に1つ存在することが必要である。また、hHGF遺伝子にプロモーターを結合したDNA断片を2-3個タンデムに挿入する方法を用いた場合には、各hHGF遺伝子の3’側にそれぞれポリアデニル化部位を存在させることが可能である。
上記の発現ベクターを用いて動物細胞例えばCHO細胞を形質転換する際には、選択マーカーを用いることが望ましい。選択マーカー遺伝子を該発現ベクターのポリアデニル化部位下流に順方向あるいは逆方向に挿入しておくと、形質転換体を得る際に、選択マーカー遺伝子を含む別のプラスミドを二重形質転換する必要がない。このような選択マーカーとしては、メトトレキセート耐性を与えるDHFR遺伝子(ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイオロジー(J.Mol.Biol.)159巻601頁(1982))、抗生物質G-418耐性を与えるNeo遺伝子(ジャーナル・オブ・モレキュラ・アプライド・ジェネティクス(J.Mol.Appl.Genet.)1巻327頁(1982))、ミコフェノール酸耐性を与える大腸菌由来のEcogpt遺伝子(プロシーディング・アンド・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)78巻2072頁(1981))、抗生物質ハイグロマイシン耐性を与えるhph遺伝子(モレキュラ・セル・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.)5巻410頁(1985))等が挙げられる。これらの各耐性遺伝子の5′上流側にはプロモーター、例えば前述のSV40由来のプロモーターが挿入されており、また、各耐性遺伝子の3′下流側には、前述のポリアデニル化部位が含まれる。
発現ベクターに上記のような選択マーカー遺伝子が挿入されていない場合には、形質転換体の選択のマーカーを有するベクター例えばpSV2neo(ジャーナル・オブ・モレキュラ・アプライト・ジェネティクス(J.Mol.Appl.Genet.)1巻327頁(1982))、pMBG(ネイチャー(Nature)294巻228頁(1981))、pSV2gpt(プロシーディング・アンド・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Prec.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)78巻2072頁(1981))、pAd-D26-1(ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイオロジー(J.Mol.Biol.)159巻601頁(1982))(J.Mol.Biol.159,601(1982))などをhHGF遺伝子の発現ベクターと共に二重形質転換し、選択マーカー遺伝子の表現形質により形質転換体を容易に選択できる。
以上のような方法で、選択されるhHGF蛋白質遺伝子を含有する細胞について選択マーカーを変更して二重形質転換を繰り返すと、発現量が約20倍上昇するので好ましい。
発現ベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法(ビロロジー(Virology)52巻456頁(1973))、エレクトロポレーション法(ジャーナル・オブ・メンブレン・バイオロジー(J.Membr.Biol.)10巻279頁(1972))等が挙げられるが、リン酸カルシウム法が一般的である。形質転換された動物細胞の培養は、常法により浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地としては、MEM、RPMI1640などを用い、5-10%の血清存在下もしくは適当量のインシュリン、デキサメサゾン、トランスフェリンの存在下、もしくは無血清下にて培養する。
hHGF蛋白質を産生している動物細胞はその培養上清中に産生されたhHGF蛋白質を分泌することから、この組換え体の培養上清を用いhHGF蛋白質の分離精製を行うことが可能である。具体的には生産されたhHGF蛋白質を含む培養上清を各種クロマトグラフィー、例えば、S-セファロース、ヘパリンセファロース、ハイドロキシアパタイトもしくは硫酸化セルロファイン等を組み合わせたクロマトグラフィーにて精製することにより、hHGF蛋白質を単離精製することができる。
本発明においては、第2図に示されるMetからはじまるプレhHGFがまず宿主内で発現される。次いで、宿主内で修飾を受けて第31番目のGlyと第32番目のGlnの間で加水分解されて31個のシグナルペプチドが切断される。次いで、N末端のGlnが脱アンモニアされてピログルタミン酸に変化したhHGFが分泌される。
かくして、本発明のN末端がピログルタミン酸に修飾されたhHGFが得られる。
(実施例)
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、その要旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
実施例1〔I〕hHGF蛋白質発現プラスミドの調製
第3図にhHGF蛋白質発現プラスミドの調製方法を示す。hHGFcDNA(バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション(B.B.R.C第163巻(2)967頁-973頁(1989))を含むBamH I-Kpn I断片すなわちhHGF蛋白翻訳開始点ATGより27塩基上流のBamH I切断点から終止コドンTAGより8塩基上流のKpn I切断点までの領域をカバーする約2.3kbのBamH I-Kpn I断片を含むプラスミドpUCHGF1DNAを常法(「モレキュラー・クローニング」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、93頁(1982))により調製した。
次に該プラスミドDNA10μgを常法に従い制限酵素Kpn Iで切断し、得られたDNA断片を常法に従いフェノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈澱により該DAN断片を精製し10μlの水に溶解した。
さらにこのDNA断片のKpn I切断点に第3図に示す両末端が制限酵素Kpn I切断点をもちかつ内部に終止コドンTGA及び制限酵素BamH I切断点を含む32塩基の合成リンカーをManiatisらの方法(「モレキュラー・クローニング」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、396頁-397頁(1982))に従い導入した。
これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを常法(「モレキュラー・クローニング」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、93頁(1982))により調製した。
次に該プラスミドDNA10μgを常法に従い制限酵素BamH Iで切断し、この制限酵素反応液を1.0%アガロースゲルによって電気泳動をすることにより目的の開始コドンATGを終止コドンTGAを含むhHGFDNA断片をベクター等の目的以外のDNA断片と分離した。Maniatisらの方法(「モレキュラー・クローニング」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、164頁(1982))に従いアガロースゲル断片から目的とするhHGF遺伝子をコードする約2.3kbのBamH I-BamH I DNA断片を調製した。得られたDNA断片の末端を常法に従いT4DNAポリメラーゼにて平滑末端にした後フェノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈澱により該DNA断片を精製し10μlの水に溶解した。
一方、発現ベクターpKCR(プロシーディング・アンド・ナチュラル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Nat.Acad.Sci.)78巻1527頁(1981))0.05μgは予め常法に従い平滑末端を生じる制限酵素Sma Iで切断し、フェノール・クロロホルム抽出を行いエタノール沈澱により精製した。これを400μlの50mMトリス-塩酸(pH8)、1mM塩化マグネシウム溶液に溶解したのちバクテリアルアルカリホスファターゼ(東洋紡、BAP-101)1ユニットを添加し、65℃下30分の反応を施し脱燐酸化処理を行った。次にこの反応液からフェノール・クロロホルム抽出とエタノール沈澱により該DNA断片を精製し10μlの水に溶解した。
上記の様に調製したpKCRベクターのDNA断片0.01μgと前述の平滑末端化されたhHGFcDNAのBamH I断片0.1μgを含む反応液(66mMトリス-塩酸pH7.6、6.6mM塩化マグネシウム10mMジチオスレイトール、66μMATP)20μl中にて14℃で12時間T4DNAリガーゼ(東洋紡LGA-101)による結合反応を行った。このT4DNAリガーゼ反応液10μlを用いて大腸菌HB101株(宝酒造)を説明書に従い形質転換し、アンピシリンを50μg/mlの濃度で含む培地上で培養することにより数十個のアンピシリン耐性株を得た。
これらの組換え体をManiatisらの方法(「モレキュラー・クローニング」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、86頁〜96頁(1982))に従い解析することにより、発現ベクターpKCRのプロモーターとポリアデニレーション部位の中間に存在する制限酵素Sma I切断部位にhHGF遺伝子が順方向に二連結したプラスミド、pKCRHGF-2プラスミドを得ることが出来た。
その構造を第4図に示す。
〔II〕hHGF蛋白質を継代的に発現する細胞株の取得
実施例1-〔I〕により作製された発現ベクターpKCR(プロシーデング・アンド・ナチュラル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Nat.Acad.Sci.)78巻(2)1527頁(1981))の制限酵素BamH I切断部位にhHGFcDNAが二個挿入されたプラスミドpKCRHGF-2をManiatisらの方法(「モレキュラー・クローニング」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、86頁〜96頁(1982))に従い組換え体の大腸菌から回収、精製しHGF発現プラスミドDNAを大量に得た。
一方形質転換細胞選択用のマーカーをコードするプラスミドpSV2neo(ジャーナル・オブ・アプライド・ジェネティクス(Journal of Applied Genetics)1巻327頁(1982))を有する組換え体の大腸菌およびpAd-D26-1(ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイオロジー(Journal of molecular biology)第159巻601頁(1982))を有する組換え体の大腸菌から前述のManiatisらの方法に従い該プラスミドDNAを回収、精製した。
得られた三種のプラスミドDNAを用いてAusubelらの方法(カレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アンド・ウイリーインターサイエンス(Greene Publishing Associates and Wiley-Inter science)9・1・1章〜9・1・4章(1987))を基にCHO細胞に二重形質転換してCHO細胞を形質転換した。
即ち、まず直径9cmのシャーレ中でFCS(牛胎児血清)が10%入ったERDF培地(極東製薬社製)中でCHO細胞をセミコンフルエントな状態になるまで培養した。次にシャーレから培地を除きそこにDNA溶液を滴加するが、該DNA溶液は予め次に示す手順に従って調製した。
まず直径9cmのシャーレ一枚につき300μlの2×HEBS溶液(2×HEBS溶液;1.6%塩化ナトリウム、0.074%塩化カリウム、0.05%燐酸水素二ナトリウム12水塩、0.2%デキストロース、1%HEPES(pH7.05))と10μgのプラスミドDNAおよび1μgのpSV2neoプラスミドDNA、1μgのpAd-D26-1プラスミドDNAを加え、滅菌された水で570μlに合わせた溶液をエッペンドルフ遠心管中に準備する。次に該DNA溶液に30μlの2.5Mの塩化カルシウム溶液を滴加しながらボルテックスミキサーを用い数秒間激しく混和する。これを室温で30分間放置するが、その間およそ10分おきにボルテックスミキサーで混和する。
この様にしてできたDNA溶液を前述の細胞にかけて室温で30分間静置した。その後FCSが10%入ったERDF培地9mlをシャーレに入れて、5%CO2存在下、37℃で4〜5時間培養した。次にシャーレから培地を除き5mlの1×TBS++溶液(1×TBS++溶液;25mMトリス-塩酸(pH7.5)、140mM塩化ナトリウム、5mM塩化カリウム、0.6mM燐酸水素二ナトリウム、0.08mM塩化カルシウム、0.08mM塩化マグネシウム)で細胞を洗浄し、1×TBS++溶液を除去した後、グリセロールを20%含む1×TBS++溶液5mlを、細胞にかけて、室温で1〜2分間静置し、上清を除去した。その後5mlの1×TBS++溶液で細胞を再び洗浄し、FCSが10%入ったERDF培地10mlをシャーレに入れて5%CO2存在下、37℃で培養した。培養後、48時間が経過した時点で培地を除き、5mlの1×TBS++溶液で細胞を洗浄した後、細胞にトリプシン-EDTA溶液(シグマ社)2mlをかけ、室温で30秒静置した。その後、トリプシン-EDTA溶液を除き、それから5分後にFCSが10%入ったERDF培地10mlをシャーレに入れて細胞を剥がし、9cmシャーレ一枚分の細胞を9cmシャーレ10枚に分けて薬剤G418(G418硫酸塩(GENETICIN);GIBCO社)を200μg/mlの濃度になるように加えて培養を続けた。その後10日が経過した時点で生き残ったG418に耐性の細胞を単離し、一つの培養用の穴がおよそ3.1cm2の24穴の培養皿を用い、それぞれFCSが10%入ったERDF培地1ml中でおよそ7日間培養し直した。
以上の細胞の培地をFCSを含まないERDF培地に代えて培養を続け72時間が経過した細胞の培地を個別に2ml集め、それをセントリコン濃縮器(ミリポア社)で50μlに遠心濃縮してそのうちの約15μlをサンプルとして、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。
これを常法に従いウエスタンプロット法で解析しhHGF蛋白質の発現を確認した。
また、Gohdaらの方法(エクスペリメンタル・セル・リサーチ(Experimental Cell Rescerch)166巻139頁〜150頁(1986))によりhHGF活性を測定し生物学的活性の存在を確認した。
さらに得られた細胞株は個別に単離され酵素イムノアッセイ法を行いhHGF蛋白質の定量を行った。
その結果、発現量の確認された細胞株B-1,B-27,B-102を得た。
実施例2
〔I〕hHGF遺伝子を有する発現ベクターを用いて繰り返し形質転換して得られる、hHGF蛋白質を継代的に発現する細胞株の取得
実施例1-〔I〕により取得した、hHGF遺伝子発現ベクターpKCRHGF-2及びミコフェノール酸耐性の形質転換細胞選択用のマーカーをコードするプラスミドpMBG(Nature294,228(1981))を有する組換え体の大腸菌から、前述のManiatisらの方法に従い該プラスミドDNAを回収、精製した。
得られた二種のプラスミドDNAを用いてAusubelらの方法(カレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)、グリーン・バブリッシング・アソシエイツ・アンド・ウイリーインターサイエンス(Greene Publishing Associates and Wiley-Inter science)9・1・1章〜9・1・4章(1987))を基に、実施例1-〔II〕によって得られたhHGF蛋白質を継代的に発現する細胞株のうち、hHGFの発現量の多いもの3株(B-1、B-27、B-102)を単離し、それらを個別に二重形質転換して該細胞を形質転換した。
すなわち、まず直径9cmシャーレの中でFCSが10%入ったERDF培地中で、前述のhHGF蛋白質を継代的に発現する細胞株を個別にセミコンフルエントな状態になるまで培養した。次にシャーレから培地を除きそこにDNA溶液を滴加するが、該DNA溶液は、10μgのpKCRHGF-2プラスミドDNA及び1μgのpMBGプラスミドDNAを用いる以外は、実施例1-〔II〕と同様の手順で調製した。
この様にしてできたDNA溶液を前述の細胞にかけて室温で30分間静置した。その後FCSが10%入ったERDF培地9mlをシャーレに入れて、5%CO2存在下、37℃で4〜5時間培養した。次にシャーレから培地を除き5mlの1×TBS++溶液(前述)で細胞を洗浄し、1×TBS++溶液を除去した後、グリセロールを20%含む1×TBS++溶液5mlを細胞にかけて、室温で1〜2分間静置し、上清を除去した。その後5mlの1×TBS++溶液で細胞を再び洗浄し、FCSが10%入ったERDF培地10mlをシャーレに入れて5%CO2存在下、37℃で培養し、48時間が経過した時点で培地を除き、5mlの1×TBS++溶液で細胞を洗浄した後、細胞にトリプシン-EDTA溶液(シグマ社)2mlをかけ、室温で30秒静置した。その後、トリプシン-EDTA溶液を除き、それから5分後にFCSが10%入ったα-MEM(-)培地10mlをシャーレに入れて細胞を剥がし、9cmシャーレ一枚の細胞を9cmシャーレ10枚に分けて薬剤ミコフェノール酸(シグマ社製)を1μg/ml及びキサンチン(シグマ社製)を250μg/mlの濃度になるように加えて培養を続けた。その後10日が経過した時点で生き残ったミコフェノール酸に耐性の細胞を単離し、一つの培養用の穴がおよそ3.1cm2の24穴の培養皿を用い、それぞれFCSが10%入ったERDF培地1ml中でおよそ7日間培養し直した。
以上の細胞の培地をFCSを含まないERDF培地に代えて培養を続け72時間が経過した細胞の培地を個別に2ml集め、それらをセントリコン濃縮器(ミリポア社)で50μlに遠心濃縮してそのうち約15μlをサンプルとしてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。
これを常法に従いウエスタンブロット法で解析しhHGF蛋白質の発現を確認した。
また、Gohdaらの方法(エクスペリメンタル・セル・リサーチ(Experimental Cell Reserch)166巻139頁〜150頁(1986))によりhHGF活性を測定し生物学的活性の存在を確認した。
その結果を第5図に示す。
さらに、得られた細胞株のうちいくつかを個別に単離し酵素イムノアッセイ法でhHGF蛋白質の発現量を確認した結果、二重形質転換前の細胞株B-102の発現量のおよそ20倍の発現量を示す細胞株BD-24を得た。
実施例3
実施例2で得たhHGF産生株BD-24を10%FCSを含むERDF培地(極東製薬製)で培養し、その培養上清液500mlを得た。これを10mlのS-Sepharose FastFlow(R)(ファルマシア社)を充填したカラムに吸着させた後、10mMリン酸ナトリウムを含むpH7.5の緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を上昇させることにより吸着蛋白質を溶出させた。組換えhHGF蛋白質は塩化ナトリウム濃度が約0.7モルの画分に溶出した。このhHGF画分をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析したところ、非還元条件下では、分子量約76,000〜92,000にブロードなバンドを与えたのみであり、還元条件下では、約60,000〜65,000にブロードなバンドを、分子量約56,000により弱いバンドを与え(これらはhHGF蛋白質のH鎖に相当する)、さらに分子量約32,000〜35,000に2本のバンドを与えた(これらはhHGF蛋白質のL鎖に相当する)。こうしたバンドの多重性及びブロードさは、hHGF蛋白質に付加した糖鎖の不均一性によって生ずるものである。
この精製hHGF蛋白質溶液の緩衝液を0.1モルの重炭酸アンモニウム水溶液に置換したのち、hHGF蛋白質量の1/50量のスタフィロコッカス・オーレウス(Stahylococcus Aureus)V8プロテアーゼ(マイルス・ラボラトリー社製)を加えて、37℃で一夜インキュベートしてペプチド混合物を分解した。この混合物溶液をC8カラム(ベーカーボンド社製,4.6×250mm)を装着した逆相高速液体クロマトグラフィーによって、アセトニトリル濃度を0%から60%に変化させ(1%/分)て、分離した。溶出した約10個のペプチドピークについて、アミノ酸組成分析を行ったところ、約18分の位置に溶出したペプチドのアミノ酸組成は、表1のようであった。この組成は、hHGFをコードするcDNAの塩基配列から推測されたアミノ酸配列のうち、読み出しのメチオニンから数えて32番目のグルタミンから始まり41番目のグルタミン酸で終わるペプチドの理論組成とほヾ一致した。

このペプチドをファスト・アトム・ボンバードメント・マススペクトロスコピー(日本電子製HX-100)によって質量分析したところ、分子量1321の位置にピークが得られ、このペプチドの分子量は1320であると決定された。32番目のグルタミンから41番目のグルタミン酸に至るペプチドの理論分子量は1337であることから、アミノ末端のグルタミンが脱アンモニアしてピログルタミン酸に変化したものと結論することが出来る。即ち、分泌されたhHGF蛋白質のN末端アミノ酸は32番目のグルタミンが修飾されて生成したピログルタミン酸であることが分かった。
(発明の効果)
本発明に係わるhHGF遺伝子を挿入された発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、今まで困難であった生物学的活性を有するhHGF蛋白質を大量、安定かつ容易に発現することが可能となり、その結果、N末端がピログルタミン酸に修飾された本発明のhHGF蛋白質を精製・取得し得るようになった。
【図面の簡単な説明】
第1図はヒト肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子の塩基配列を表わす。
第2図はヒト肝実質細胞増殖因子のアミノ酸配列を示す。
配列中、第1番目〜第31番目(-)はシグナルペプチドを表わし、Zは修飾される前がGlnを表わし、修飾された後はピログルタミン酸を表わす。
第3図は、ヒト肝実質細胞増殖因子を発現するベクターを構築する工程を表わす。
第4図は、本発明のヒト肝実質細胞増殖因子をコードするDNAを有する発現ベクターの構造を表わす。
第5図は、本発明のヒト肝実質細胞増殖因子をコードするDNAを有する発現ベクターを有するCHO細胞が産生するヒト肝実質細胞増殖因子を含む培養上清の生物学的活性を示したものである。
【図面】

















 
訂正の要旨 訂正の要旨
特許第2963163号発明の明細書中の特許請求の範囲について、
「【請求項1】下記アミノ酸配列(配列中、Xaaはピログルタミン酸を表わす。)で表わされるヒト肝実質細胞増殖因子。
(アミノ酸配列は略)」を、
特許請求の範囲の減縮を目的として、
「【請求項1】CHO細胞が産生する組み換え蛋白質であることを特徴とする、下記アミノ酸配列(配列中、Xaaはピログルタミン酸を表わす。)で表わされる生物学的活性を有するヒト肝実質細胞増殖因子。
(アミノ酸配列は略)」と訂正する。
審決日 2001-08-13 
出願番号 特願平2-200898
審決分類 P 1 41・ 851- Y (C07K)
最終処分 成立  
前審関与審査官 六笠 紀子  
特許庁審判長 眞壽田 順啓
特許庁審判官 佐伯 裕子
田村 明照
登録日 1999-08-06 
登録番号 特許第2963163号(P2963163)
発明の名称 ヒト肝実質細胞増殖因子  
代理人 藍原 誠  
代理人 藍原 誠  
代理人 釜田 淳爾  
代理人 今村 正純  
代理人 塩澤 寿夫  
代理人 今村 正純  
代理人 釜田 淳爾  
代理人 塩澤 寿夫  

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