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審決分類 審判 訂正 ただし書き2号誤記又は誤訳の訂正 訂正する C12N
管理番号 1384002
総通号数 5 
発行国 JP 
公報種別 特許審決公報 
発行日 2022-05-27 
種別 訂正の審決 
審判請求日 2021-11-09 
確定日 2022-01-20 
訂正明細書 true 
事件の表示 特許第６６８７５３２号に関する訂正審判事件について、次のとおり審決する。 
結論 特許第６６８７５３２号の明細書を本件審判請求書に添付された訂正明細書のとおり訂正することを認める。 
理由 第１ 手続の経緯
本件特許第６６８７５３２号は、平成２７年３月２７日（パリ条約による優先権主張 ２０１４年３月２８日 （ＥＳ）スペイン）を国際出願日とする特願２０１６−５６０４３１号として特許出願されたものであって、その請求項１〜１６に係る発明について、令和２年４月６日に特許権の設定登録がなされ、その後、令和３年１１月９日に本件の訂正審判が請求されたものである。

第２ 請求の趣旨及び訂正の内容
１ 請求の趣旨
本件請求の趣旨は、特許第６６８７５３２号の明細書を本件審判請求書に添付した訂正明細書のとおり訂正することを認める、との審決を求めるものである。

２ 訂正の内容
請求人が求めている訂正の内容は、以下のとおりである。

（１）訂正事項１
明細書の段落【００５８】、【００９８】、【０１３５】にそれぞれ「表2 1において」と記載されているのを、「表2において」に訂正する。

（２）訂正事項２
明細書の段落【０１３５】に「ND1 30 遺伝子」と記載されているのを、「ND1 遺伝子」に訂正する。

第３ 当審の判断
１ 訂正事項１について
（１）訂正の目的について
本件訂正前の明細書の段落【００５８】には、「（v）表2 1において示されたND1遺伝子におけるCpGサイト」と記載されている一方で、訂正前の明細書中には表2 1は存在せず、訂正前の明細書の段落【００４０】に表1、訂正前の明細書の段落【００４４】に表2がそれぞれ記載されている。
したがって、訂正前の明細書の段落【００５８】の「表2 1において」が、それぞれ、「表1」または「表2」いずれかの誤りであるといえ、以下、それぞれの可能性を検討する。
まず、「表1」の誤りである可能性を検討すると、訂正前の明細書の段落【００４０】には、「表1」について、「D-ループ領域における位置16386および256のCpGのリスト」と記載されていることから、訂正前の明細書の段落【００５８】の（ｖ）における「表2 1において」を「表1において」と解した場合、同段落中の（ｖ）の「ND1遺伝子におけるCpGサイト」という記載と整合性がない。
次に、「表2」の誤りである可能性を検討すると、訂正前の明細書の段落【００４４】には、「表2」について、「位置3313と3686との間のND1遺伝子におけるCpGサイトのリスト」と記載されており、訂正前の明細書の段落【００５８】の（ｖ）における「表2 1において」を「表2において」と解した場合、同段落中の（ｖ）の「ND1遺伝子におけるCpGサイト」という記載と何ら矛盾がない。
したがって、訂正前の明細書の段落【００５８】における「表2 1において」は「表2において」の誤りであることが明らかである。
本件訂正前の明細書の段落【００９８】、【０１３５】それぞれにおける「表2 1において」という記載についても同様に、「表2において」の誤りであることが明らかである。
以上より、訂正事項１は、特許法第126条第1項ただし書第２号に規定する誤記の訂正を目的とするものである。

（２）願書に最初に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であることについて
上記（１）で述べたとおり、訂正事項１は、訂正前の明細書の段落【００５８】、【００９８】、【０１３５】それぞれにおける、誤りである「表2 1において」を正しい記載である「表2において」に訂正し、願書に最初に添付した明細書の段落【００４４】に記載された表2を引用する記載に訂正するものであるから、願書に最初に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第126条第5項の規定に適合するものである。

（３）実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更する訂正ではないことについて
上記（１）で述べたとおり、訂正事項１は、誤記を訂正するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第126条第6項の規定に適合するものである。

（４）独立特許要件について
訂正後の特許請求の範囲の請求項１〜１６に記載されている事項により特定される発明が特許出願の際独立して特許を受けることができないとする理由は見出せないから、訂正事項１は、特許法第126条第7項の規定に適合するものである。

２ 訂正事項２について
（１）訂正の目的について
本件訂正前の明細書の段落【０１３５】には、「表4において示されたND1 30遺伝子におけるCHGサイト」と記載されているが、訂正前の明細書の段落【００５２】には、表4について「位置3313と3686との間のND1遺伝子におけるCHGサイトのリスト」と記載されているほか、訂正前の明細書中のいずれの箇所にも、「ND1 30遺伝子」は記載がされていないことから、訂正前の明細書の段落【０１３５】の「ND1 30遺伝子」は、「ND1遺伝子」の誤りであることが明らかである。
したがって、訂正事項２は、特許法第126条第1項ただし書第２号に規定する誤記の訂正を目的とするものである。

（２）願書に最初に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であることについて
願書に最初に添付した明細書の段落【００５２】では、表4について「位置3313と3686との間のND1遺伝子におけるCHGサイトのリスト」と記載されており、訂正事項２は、上記（１）で述べたとおり、表4についての誤りである「ND1 30遺伝子」との記載を、正しい記載である「ND1遺伝子」に訂正するものであるから、願書に最初に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第126条第5項の規定に適合するものである。

（３）実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更する訂正ではないことについて
上記（１）で述べたとおり、訂正事項２は、誤記を訂正するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第126条第6項の規定に適合するものである。

（４）独立特許要件について
訂正後の特許請求の範囲の請求項１〜１６に記載されている事項により特定される発明が特許出願の際独立して特許を受けることができないとする理由は見出せないから、訂正事項２は、特許法第126条第7項の規定に適合するものである。

第４ むすび
以上のとおりであるから、本件訂正審判の請求は、特許法第126条第1項ただし書第２号に掲げる事項を目的とし、かつ、同条第５項ないし第７項の規定に適合するものである。
よって、結論のとおり審決する。

 
発明の名称 （５４）【発明の名称】神経変性疾患のミトコンドリアマーカー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経疾患の診断方法の一部として分類される。
【背景技術】
【０００２】
少なからぬの数の神経変性疾患が、変質したミトコンドリア機能によって引き起こされ、または、これに関連づけられる。
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）は、このグループ内である。ＡＤおよびＰＤの病態生理的特徴は、凝集タンパク質の沈着と関連がある。具体的には、ＡＤは、神経原線維のもつれにおける細胞内リン酸化タウ凝集体および老人斑におけるβ−アミロイドペプチドの細胞外凝集体の形成に関連づけられ、ＰＤは、いわゆるレビー小体およびレビーニューライトの主要構成成分を構成する異常なα−シヌクレイン凝集体の形成に関連づけられる。
【０００４】
アルツハイマー患者が彼らの脳組織におけるサブユニットＮＤ４の減じられたレベルを示すこと、および、パーキンソン患者が黒質におけるＮＤ６の減少させられたレベルを示すことが、認められている。さらに、遺伝学的研究は、いくつかのＣＯＸ遺伝子における、およびＤ−ループ領域における、突然変異だけでなく、ＡＤを有する被験者の脳における、およびＰＤを有する被験者の黒質における、ｍｔＤＮＡの欠失を同定している。
【０００５】
種々の方法および戦略が、神経変性疾患の、具体的にはＡＤおよびＰＤの、発症および発病の診断、予測のための技術において開発されている。そのように、神経変性疾患のための診断方法は、ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型）技法または他の関連技法の採用によるミトコンドリアＤＮＡにおける突然変異の同定に基づいて説明されている。国際公開第９８／０３８３３４号パンフレットの文書は、ＣＯＸ遺伝子における突然変異の同定に基づいたＡＤ診断の方法を説明する。それはまた、被験者のミトコンドリアＤＮＡサンプルにおける一塩基多型の同定による被験者におけるＰＤ診断の方法を提案する（国際公開第２０００／０６３４４１号パンフレット）。従来技術の他の文献は、ミトコンドリア転写のプロセスを制御する核タンパク質コード遺伝子における多型の同定に基づいたアルツハイマーまたはパーキンソン病の診断方法を説明する。現在までになされた努力にも関わらず、ＡＤおよびＰＤといった神経変性疾患についての診断の、さらには、そのような疾患のステージの診断のための、および同疾患の進展を予知するための、信頼できる方法に対するニーズが残されている。
【発明の概要】
【０００６】
第１の態様において、発明は、被験者におけるアルツハイマー病およびパーキンソン病から選択された神経変性疾患の発病のリスクを診断または決定するためのインビトロ法に関し、前記被験者は、ミトコンドリアＤＮＡを含む前記被験者からのサンプルにおいて、Ｄ−ループ領域におけるおよび／またはＮＤ１遺伝子におけるメチル化パターンを含み、前記メチル化パターンは、
ｉ．表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイト、
ｉｉ．表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイト、
ｉｉｉ．表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイト、
ｉｖ．表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイト、および／または
ｖ．表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイト
によって形成されたグループから選択された少なくとも１つのサイトにおいて決定され、
Ｄ−ループ領域における前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、Ｄ−ループ領域における前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、Ｄ−ループ領域における前記ＣＨＨサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、ＮＤ１遺伝子における前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、および／またはＮＤ１遺伝子における前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、それは、前記被験者がアルツハイマー病に罹患していること、または前記被験者がアルツハイマー病を発病する高められたリスクを有することを示し、または、
Ｄ−ループ領域における前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、Ｄ−ループ領域における前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、および／またはＤ−ループ領域における前記ＣＨＨサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、それは、前記被験者がパーキンソン病に罹患していること、または前記被験者がパーキンソン病を発病する高められたリスクを有することを示す。
【０００７】
第２の態様において、発明は、被験者におけるアルツハイマー病およびパーキンソン病から選択された神経変性疾患の予防的治療の施行のための被験者を選択するためのインビトロ法に関し、前記被験者は、ミトコンドリアＤＮＡを含む前記被験者からのサンプルにおいて、Ｄ−ループ領域におけるおよび／またはＮＤ１遺伝子におけるメチル化パターンを含み、前記メチル化パターンは、
ｉ．表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイト、
ｉｉ．表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイト、
ｉｉｉ．表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイト、
ｉｖ．表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイト、および／または
ｖ．表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイト
によって形成されたグループから選択された少なくとも１つのサイトにおいて決定され、
Ｄ−ループ領域における前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、Ｄ−ループ領域における前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、Ｄ−ループ領域における前記ＣＨＨサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、ＮＤ１遺伝子における前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、および／またはＮＤ１遺伝子における前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化は、前記被験者がアルツハイマー病を予防することを目的とした治療を受けるのに適格であることを示し、または、
Ｄ−ループ領域における前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、Ｄ−ループ領域の前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、および／またはＤ−ループ領域における前記ＣＨＨサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化は、前記被験者がパーキンソン病を予防することを目的とした治療を受けるのに適格であることを示す。
【０００８】
第３の態様において、発明は、被験者におけるアルツハイマー病またはパーキンソン病から選択された神経変性疾患の進行を監視するためのインビトロ法に関し、この方法は、
ａ）ミトコンドリアＤＮＡを含む前記被験者からのサンプルにおいて、Ｄ−ループ領域におけるおよび／またはＮＤ１遺伝子におけるメチル化パターンを決定するステップであって、前記メチル化パターンは、
ｉ．表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイト、
ｉｉ．表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイト、
ｉｉｉ．表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイト、
ｉｖ．表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイト、および／または
ｖ．表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイト
によって形成されたグループから選択された少なくとも１つのサイトにおいて決定されるステップと、
ｂ）ステップａ）において決定されたメチル化パターンを前記疾患のより早いステージにおいて得られた前記メチル化パターンと比較するステップと
を備え、疾患のより早いステージにおいて決定された前記メチル化パターンに対する、Ｄ−ループ領域における前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、Ｄ−ループ領域における前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、Ｄ−ループ領域における前記ＣＨＨサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、ＮＤ１遺伝子における前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、および／またはＮＤ１遺伝子における前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化は、アルツハイマー病の発達を示し、および、
疾患のより早いステージでの前記決定されたメチル化パターンに対する、Ｄ−ループ領域における前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、Ｄ−ループ領域における前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、および／またはＤ−ループ領域における前記ＣＨＨサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化は、パーキンソン病の発達を示す。
【０００９】
第４の態様において、発明は、被験者におけるアルツハイマー病の発病のリスクを診断または決定するためのインビトロ法に関し、前記被験者は、前記被験者からのミトコンドリアＤＮＡを備えるサンプルにおいて、ＮＣＢＩデータベースにおいてアクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９でヌクレオチドを含み、前記被験者のミトコンドリアＤＮＡの分子の少なくとも６０％における、前記多型位置でのヌクレオチドＣの検出または前記多型位置でのヌクレオチドＣの存在は、前記被験者が前記疾患に罹患していること、または、前記被験者が前記疾患を発病する高められたリスクを有することを示す。
【００１０】
第５の態様において、発明は、アルツハイマー病のための予防的治療を施行される被験者を選択するためのインビトロ法に関し、この方法は、前記被験者からのミトコンドリアＤＮＡを含むサンプルにおいて、ＮＣＢＩデータベースにおいてアクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９でのヌクレオチドを決定することを含み、前記被験者からのミトコンドリアＤＮＡ分子の少なくとも６０％における、前記多型位置でのヌクレオチドＣの検出または前記多型位置でのヌクレオチドＣの存在は、前記被験者がアルツハイマー病を予防することを目的とした治療を受けるのに適格であることを示す。
【００１１】
第６の態様において、発明は核酸に関し、この核酸は、
（ｉ）ミトコンドリアＤＮＡの領域における少なくとも９つの連続するヌクレオチドを備える核酸であって、前記領域は、
ａ）表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイト、
ｂ）表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイト、
ｃ）表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイト、
ｄ）表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイト、および
ｅ）表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイト
によって形成されたグループから選択された少なくとも１つのメチル化サイトを備える、核酸と、
（ｉｉ）ミトコンドリアＤＮＡ領域の領域における少なくとも９つの連続するヌクレオチドを備える核酸であって、前記領域は、
ａ）表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイト、
ｂ）表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイト、
ｃ）表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイト、
ｄ）表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイト、および
ｅ）表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイト
によって形成されたグループから選択された少なくとも１つのメチル化サイトを備え、前記ＣｐＧ、ＣＨＧ、またはＣＨＨサイトにおけるシトシンに対応する位置は、ウラシルである、核酸と、
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の核酸と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと
によって形成されたグループから選択される。
【００１２】
第７の態様において、発明はキットに関し、このキットは、
ｉ．表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイト、
ｉｉ．表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイト、
ｉｉｉ．表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイト、
ｉｖ．表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイト、および／または
ｖ．表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイト
によって形成されたグループから選択されたメチル化サイトを備えるミトコンドリアＤＮＡ配列とメチル化に依存した手法で特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを備える。
【００１３】
第８の態様において、発明はキットに関し、このキットは、
（ｉ）表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイト、
（ｉｉ）表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイト、
（ｉｉｉ）表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイト、
（ｉｖ）表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイト、および／または
（ｖ）表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイト
によって形成されたグループからの選択されたミトコンドリアＤＮＡにおけるメチル化サイトに対し、位置５’でまたは位置３’で特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを備え、前記位置におけるメチル化されたシトシンは、ウラシル、または、そのハイブリダイゼーション特性においてシトシンとは区別可能な別の塩基に変換されている。
【００１４】
最後に第９の態様において、発明は、ミトコンドリアＤＮＡのメチル化パターンを決定するための、および、アルツハイマー病およびパーキンソン病から選択された被験者における神経変性疾患の診断を決定するための、第７および第８の発明の態様において定義されたキットの使用に言及する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】ＡＤの病理に関連するケースにおける嗅内皮質におけるＤ−ループのアンプリコンにおけるＣｐＧサイトのためのグラフＬｏｇ２（ＯＲ）である。５’から３’のメチル化サイトがＸ軸に表される。ダイヤ印のサイトは、差別的にメチル化されたサイトである（ＦＤＲ＜０．０５）。点は、各サイトにつき１つのＯＲ推定値であり、帯は、すべての９５％信頼区間のまとまりの帯である。Ｃ：サンプルコントロール、ＡＤ：アルツハイマー病。
【図１Ｂ】ＡＤの病理に関連するケースにおける嗅内皮質におけるＤ−ループのアンプリコンにおけるＣＨＧサイトのためのグラフＬｏｇ２（ＯＲ）である。５’から３’のメチル化サイトがＸ軸に表される。ダイヤ印のサイトは、差別的にメチル化されたサイトである（ＦＤＲ＜０．０５）。点は、各サイトにつき１つのＯＲ推定値であり、帯は、すべての９５％信頼区間のまとまりの帯である。Ｃ：サンプルコントロール、ＡＤ：アルツハイマー病。
【図１Ｃ】ＡＤの病理に関連するケースにおける嗅内皮質におけるＤ−ループのアンプリコンにおけるＣＨＨサイトのためのグラフＬｏｇ２（ＯＲ）である。５’から３’のメチル化サイトがＸ軸に表される。ダイヤ印のサイトは、差別的にメチル化されたサイトである（ＦＤＲ＜０．０５）。点は、各サイトにつき１つのＯＲ推定値であり、帯は、すべての９５％信頼区間のまとまりの帯である。Ｃ：サンプルコントロール、ＡＤ：アルツハイマー病。
【図２Ａ】ＡＤの病理に関連するケースの嗅内皮質におけるＮＤ１のアンプリコンにおけるＣｐＧサイトのためのグラフＬｏｇ２（ＯＲ）である。５’から３’のメチル化サイトがＸ軸に表される。ダイヤ印の場所は、すべての９５％信頼区間のまとまりの、差別的にメチル化されたサイトである。Ｃ：コントロールサンプル、ＡＤ：アルツハイマー病。
【図２Ｂ】ＡＤの病理に関連するケースの嗅内皮質におけるＮＤ１のアンプリコンにおけるＣＨＧサイトのためのグラフＬｏｇ２（ＯＲ）である。５’から３’のメチル化サイトがＸ軸に表される。ダイヤ印の場所は、すべての９５％信頼区間のまとまりの、差別的にメチル化されたサイトである。Ｃ：コントロールサンプル、ＡＤ：アルツハイマー病。
【図２Ｃ】ＡＤの病理に関連するケースの嗅内皮質におけるＮＤ１のアンプリコンにおけるＣＨＨサイトのためのグラフＬｏｇ２（ＯＲ）である。５’から３’のメチル化サイトがＸ軸に表される。ダイヤ印の場所は、すべての９５％信頼区間のまとまりの、差別的にメチル化されたサイトである。Ｃ：コントロールサンプル、ＡＤ：アルツハイマー病。
【図３】ＰＤを有する患者における黒質におけるＤ−ループのアンプリコンにおけるＣｐＧおよびＣｐＧではない（ＣＨＧおよびＣＨＨ）サイトのためのグラフＬｏｇ２（ＯＲ）である。５’から３’のメチル化サイトがＸ軸に表される。ダイヤ印のサイトは、差別的にメチル化されたサイトである（ＦＤＲ＜０．０５）。点は、各サイトにつき１つの推定ＯＲ値であり、帯は、すべての９５％信頼区間のまとまりの帯である。Ｃ：コントロールサンプル、ＰＤ：パーキンソン病。
【図４Ａ】３、６、および１２か月のＡＰＰ／ＰＳ１マウスおよび野生マウス（ＷＴ）の前頭皮質におけるＤ−ループのアンプリコンにおけるＣｐＧサイトのためのグラフｌｏｇ２（ＯＲ）である。５’から３’による類別されたメチル化サイトがＸ軸に表される。ダイヤ印のサイトは、差別的にメチル化されたサイトである（ＦＤＲ＜０．０５）。点は、各サイトにつき１つの推定ＯＲ値であり、帯は、すべての９５％信頼区間のまとまりの帯である。Ｃ：コントロールサンプル、ＷＴ：野生、ＴＧ：トランスジェニック。
【図４Ｂ】３、６、および１２か月のＡＰＰ／ＰＳ１マウスおよび野生マウス（ＷＴ）の前頭皮質におけるＤ−ループのアンプリコンにおけるＣＨＧサイトのためのグラフｌｏｇ２（ＯＲ）である。５’から３’による類別されたメチル化サイトがＸ軸に表される。ダイヤ印のサイトは、差別的にメチル化されたサイトである（ＦＤＲ＜０．０５）。点は、各サイトにつき１つの推定ＯＲ値であり、帯は、すべての９５％信頼区間のまとまりの帯である。Ｃ：コントロールサンプル、ＷＴ：野生、ＴＧ：トランスジェニック。
【図５Ａ】３、６、および１２か月のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの前頭皮質におけるＤ−ループのアンプリコンにおけるＣＧサイトのためのグラフＬｏｇ２（ＯＲ）である。５’から３’による類別されたメチル化サイトがＸ軸に表される。ダイヤ印のサイトは、差別的にメチル化されたサイトである（ＦＤＲ＜０．０５）。点は、各サイトにつき１つの推定ＯＲ値であり、帯は、すべての９５％信頼区間のまとまりの帯である。Ｃ：コントロールサンプル、ＴＧ：トランスジェニック。
【図５Ｂ】３、６、および１２か月のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの前頭皮質におけるＤ−ループのアンプリコンにおけるＣＨＧサイトのためのグラフＬｏｇ２（ＯＲ）である。５’から３’による類別されたメチル化サイトがＸ軸に表される。ダイヤ印のサイトは、差別的にメチル化されたサイトである（ＦＤＲ＜０．０５）。点は、各サイトにつき１つの推定ＯＲ値であり、帯は、すべての９５％信頼区間のまとまりの帯である。Ｃ：コントロールサンプル、ＴＧ：トランスジェニック。
【図５Ｃ】３、６、および１２か月のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの前頭皮質におけるＤ−ループのアンプリコンにおけるＣＨＨサイトのためのグラフＬｏｇ２（ＯＲ）である。５’から３’による類別されたメチル化サイトがＸ軸に表される。ダイヤ印のサイトは、差別的にメチル化されたサイトである（ＦＤＲ＜０．０５）。点は、各サイトにつき１つの推定ＯＲ値であり、帯は、すべての９５％信頼区間のまとまりの帯である。Ｃ：コントロールサンプル、ＴＧ：トランスジェニック。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の著者は、被験者からのミトコンドリアＤＮＡのサンプルにおけるメチル化パターンの決定に基づいて神経変性疾患を診断するための方法を開発している。発明者は、実施例において論証されるごとく、健康な被験者と比較された場合、ＡＤまたはＰＤに罹患している被験者におけるＤ−ループ領域およびＮＤ１遺伝子におけるメチル化パターンには、驚くべきことにバリエーションが存在する、ということを見出した。さらに発明者は、これらの疾患の発病に関連づけられた差別的なメチル化パターンを発見した。
発明の第１の方法
発明の第１の特徴は、被験者におけるアルツハイマー病およびパーキンソン病から選択された神経変性疾患を発病するリスクを診断または決定するためのインビトロ法（以下、発明の第１の方法）に関し、この方法は、ミトコンドリアＤＮＡを備える前記被験者からのサンプルにおいてＤ−ループ領域におけるおよび／またはＮＤ１遺伝子におけるメチル化パターンを決定することを含み、前記メチル化パターンは、
（ｉ）表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイト、
（ｉｉ）表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイト、
（ｉｉｉ）表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイト、
（ｉｖ）表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイト、および／または
（ｖ）表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイト
によって形成されたグループから選択された少なくとも１つのサイトにおいて決定され、Ｄ−ループ領域における前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、Ｄ−ループ領域における前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、Ｄ−ループ領域における前記ＣＨＨサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、ＮＤ１遺伝子における前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、および／またはＮＤ１遺伝子における前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化が存在し、それは、前記被験者がアルツハイマー病に罹患していること、または前記被験者がアルツハイマー病を発病する高められたリスクにあることを示し、または、Ｄ−ループ領域における前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、Ｄ−ループ領域における前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、および／またはＤ−ループ領域における前記ＣＨＨサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化が存在し、それは、前記被験者がパーキンソン病に罹患していること、または前記被験者がパーキンソン病を発病する高められたリスクにあることを示す。
【００１７】
本明細書において使用される「診断」という用語は、被験者における可能な疾患を決定および／または同定しようとするプロセス、すなわち診断手順、ならびにこのプロセスを通じて到達した意見、すなわち診断意見、の両方を言う。そのようなものとして、それはまた、治療および予後についての医学的決定がなされるのを可能にする別個および別々のカテゴリに個人のステータスを分類しようとする試みとしても理解され得る。当業者によって理解されるように、そのような診断は、そうであることが好ましいとはいえ、診断される被験者の１００％について正しいわけではない。しかしながら用語は、被験者の統計学的に有意な部分が、疾患、発明の文脈では特にアルツハイマー病およびパーキンソン病から選択された神経変性疾患、に罹患している、またはその疾病素質がある、と同定され得ることを要求する。当業者は、異なる周知の統計学的評価ツールを使用して、たとえば、信頼区間を決定すること、ｐ値を決定すること、スチューデントのｔ検定、マン・ホイットニー検定、等により、一部が統計学的に有意であるかどうかを決定し得る（Ｄｏｗｄｙ Ｗｅａｒｄｅｎ，１９８３を参照）。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは、０．０５、０．０２５、０．００１であるか、またはより低い。
【００１８】
本明細書において使用される「神経変性疾患を発病するリスク」という表現は、神経変性疾患の発病に対する被験者の疾病素質、罹病性、または傾向のことを言う。神経変性疾患を発病するリスクは一般的に、高いもしくは低いリスク、または、より高いもしくはより低いリスクが存在することを暗示する。そのように被験者は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病またはパーキンソン病、を発病する高いリスクを有し、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％の、この疾患を発病する可能性を有する。同様に、神経変性疾患、特にアルツハイマー病またはパーキンソン病、を発病する低いリスクにある被験者は、少なくとも０％、または少なくとも１％、または少なくとも２％、または少なくとも３％、または少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも４９％からの、疾患を発病する少なくとも１つの確率を有する被験者である。
【００１９】
一般的に、「リスクを予測する」、「リスク予測」、等の表現は、高いにせよ低いにせよ、アルツハイマー病またはパーキンソン病から選択された神経変性疾患を発病する、患者が有するリスクのことを言う。当業者によって理解されるように、予測（またはリスク）は、好ましいとはいえ、評価される被験者の１００％について正しいものである必要はないが、そうであることは好ましい。しかしながら用語は、被験者の統計学的に有意な部分がより高い確率で、特定の結果を有するものと同定され得ることを要求する。当業者は、評定のためのいくつかの周知の統計学的ツール、たとえば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、交差検証分類係数、等を使用して（より詳細には、“Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ”Ｄｏｗｄｙ ａｎｄ Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３）、一部が統計学的に有意であるかどうかを困難なく決定し得る。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは、０．１、０．０５、０．０２、０．０１であるか、またはより低い。
【００２０】
本明細書において使用される「神経変性疾患」という用語は、運動、感覚、および認知系におけるニューロンの選択的および対称的消失によって特徴づけられる、慢性および進行性のプロセスを含む。
【００２１】
「アルツハイマー病」または「老人性認知症」またはＡＤという用語は、老人斑や神経突起のもつれの出現と、臨床的には記憶の進行性欠損、錯乱、行動問題、身の回りの世話についての無能力、漸進的な身体的劣化、および最終的には死となって顕われる、進行性のニューロン消失とによって特徴づけられる、特定の変性脳疾患に関連づけられた、精神的な障害のことを言う。好ましい実施形態において、ブラークステージングによる任意のステージでのアルツハイマー病は、
−ステージＩ〜ＩＩ：神経原線維のもつれの存在によって影響を受ける脳部位が、脳の経嗅内野領域に対応する、
−ステージＩＩＩ〜ＩＶ：影響を受ける脳部位が、海馬といった辺縁系領域の部位にも拡大する、
−ステージＶ〜ＶＩ：影響を受ける脳部位が、新皮質領域をも含む、
である。
【００２２】
神経病理学的ステージによるこの分類は、既存の疾患の臨床的進展と相互に関連し、記憶の衰えと嗅内皮質および海馬における神経原線維変化および神経突起斑形成との間の並行が存在する（ステージＩからＩＶ）。また、等皮質でのこれらの変化の存在（ステージＶおよびＶＩ）は、臨床的に深刻な変調と相互に関連する。経嗅内野状態（Ｉ〜ＩＩ）は、疾患の臨床的に無症状の期間に対応する。辺縁系状態（ＩＩＩ〜ＩＶ）は、臨床的に初期のＡＤに対応する。新皮質状態は、完全に発病したＡＤに対応する。
【００２３】
本明細書において使用される「パーキンソン病」、または「特発性パーキンソニズム」、または「震顫麻痺」、またはＰＤという用語は、運動制御、振戦、筋強剛、歩くこと、座ること、食べること、話すこと、等といったすべての種類の運動における寡動、ならびに姿勢保持反射障害の問題を含む、慢性変性疾患のことを言う。疾患の症状は、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの選択的変性に明確に関連づけられる。ドーパミン系の脱落は、いわゆるレビー小体におけるα−シヌクレイン凝集を含むさまざまな細胞学的変化を引き起こす線条体ニューロンの結果的な消失を含む。「黒質」は、視床の下の中脳の上部に位置する基底核の核であり、その色をニューロメラニンから得る。好ましい実施形態において、ＰＤは、ブラークステージングによるステージ、
−ステージＩ：影響を受ける部位が、背側運動核および／または中間網様体である、
−ステージＩＩ：影響を受ける部位が、青斑核および縫線核に拡大する、
−ステージＩＩＩ：影響を受ける部位が、中脳、特に、黒質緻密部に拡大する、
−ステージＩＶ：影響を受ける部位が、前内側側頭中間皮質および不等皮質の経嗅内野領域に拡大する、
−ステージＶ：影響を受ける部位が、島皮質、帯状回皮質、および側頭回に拡大する、
−ステージＶＩ：影響を受ける部位が、皮質の前頭および頭頂の部位に拡大する、
のいずれかにおけるものである。
【００２４】
本明細書において使用される「被験者」という用語は、人、たとえば、人類、非人類霊長類（たとえば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル類）、トリ、サカナ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマといった家畜、イヌおよびネコといったペット、哺乳動物、マウス、ラット、およびモルモットといった齧歯動物を含む実験動物のことを言う。用語は、特定の年齢または性別を表さない。発明の特定の実施形態において、被験者は哺乳動物である。発明の好ましい実施形態において、被験者はヒトである。
【００２５】
本明細書において使用される「ミトコンドリアＤＮＡを備えるサンプル」という表現は、メチル化パターンを検出するのに適したミトコンドリアからの遺伝物質が存在する被験者から得られうる任意のサンプルのことを言う。
【００２６】
本明細書において使用される「ミトコンドリアＤＮＡ」または「ｍｔＤＮＡ」という用語は、生存生物のミトコンドリアの中に位置する遺伝物質のことを言う。それは、閉環状二本鎖分子である。ヒトにおいてそれは、Ｈ鎖とＬ鎖との間に分散させられた少数の遺伝子を含む１６，５６９塩基対からなる。ミトコンドリアＤＮＡは、３７の遺伝子、すなわち、２のリボソームＲＮＡ、２２の転写ＲＮＡ、および酸化的リン酸化に関与する１３のタンパク質をコードする。
【００２７】
発明の特定の実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡを備えるサンプルは、固体組織バイオプシーまたは生物流体から選択される。サンプルは、当業者に知られている従来の方法によって得られうる。
【００２８】
より一層特定の実施形態において、生物流体は、末梢血または脳脊髄液から選択される。
より一層特定の実施形態において、前記固体組織は、脳組織である。
発明の好ましい実施形態において、被験者を診断することが所望される場合、またはＰＤを発病するリスクを決定することが所望される場合、前記サンプルは、黒質から得られた脳組織サンプルである。
【００２９】
本方法にしたがってメチル化パターンを決定することが所望される材料、すなわちｍｔＤＮＡが、好ましくは固体組織または生物流体におけるものである場合、それはサンプルからの従来の核酸抽出に進み、この核酸抽出はこのための任意の適切な技法を使用する。発明の好ましい実施形態において、発明の実現に適したＤＮＡフラクションは、３５のトータルＤＮＡである。ＤＮＡ抽出は、限定ではないが、密度勾配遠心法、エタノールとともに水溶性フェノールまたはクロロホルムを使用した二段階での抽出、カラムクロマトグラフィ、市販のキット、たとえば、「Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎｅ ｆａｓｔ ＤＮＡ（登録商標） Ｋｉｔｓ」もしくは「ＱＩＡａｍｐ（登録商標） ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、「Ｇ−Ｓｐｉｎ ＩＩｐ」（Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｋｏｒｅａ）、または「Ｂｉｏ １０１ Ｆａｓｔ Ｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ（登録商標），Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）を使用した、ＤＮＡがそれ自身を、ガラスおよび／または珪酸塩、たとえば、プレパラートまたは結晶皿としての珪藻土に結合させる能力に基づいた方法、または米国特許第５，０５７，４２６号明細書、米国特許第４，９２３，９７８号明細書、および欧州特許出願公開第０５１２７６７号明細書において説明された方法を含む、当業者に知られている方法を使用して実行され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１．″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ″，３ｒｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｖｏｌ．１−３）。
【００３０】
所望される場合、本方法は、ミトコンドリアフラクションがあらかじめ分離されていて、後続してそのＤＮＡが分離された、サンプルにおいて実行され得る。ミトコンドリアフラクションの分離は、任意の知られている細胞フラクショネーション方法を使用して実行され得る。そのような方法は、（たとえば、フィコールまたはパーコールの）密度勾配を応用することによる分画遠心法が後に続く、膜の物理的破砕、超音波の印加、圧力印加、または酵素技法を含む技法による、従来の細胞破砕を備える。それらはまた、市販のキット、たとえば、「Ｑｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、または「Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｆｏｒ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用し得る。これらのキットは、同一の基本原理、すなわち、ミトコンドリアフラクションを分離または濃縮するための、細胞溶解および分画遠心法に基づく。
【００３１】
発明の第１の方法は、ミトコンドリアＤＮＡを備える被験者からのサンプルにおいてメチル化パターンを決定することを含む。本明細書において使用される「ＤＮＡメチル化」という用語は、ＤＮＡのシトシンヌクレオチド（Ｃ）またはアデニン（Ａ）へのメチル基（−ＣＨ３）の付加を含む生化学プロセスのことを言う。シトシンの５位でのＤＮＡメチル化は、遺伝子抑制の特異的効果を有し、検査された脊椎動物のすべてにおいて見出されている。
【００３２】
本明細書において使用される「メチル化パターン」という用語は、１つ以上のヌクレオチドのメチル化の存在または欠如のことを言うが、これに限定されない。このように、前記１つ以上のヌクレオチドは、単一の核酸分子に含まれる。
【００３３】
前記１つ以上のヌクレオチドは、メチル化されることもされないこともできる。単一のヌクレオチドを考慮しただけの場合、「メチル化ステータス」という用語もまた使用され得る。２つ以上の核酸分子が考慮された場合、メチル化パターンは定量化され得る。
【００３４】
本明細書において使用される「Ｄ−ループ」または「コントロール領域」という用語は、Ｈ鎖の短いセグメントである７Ｓ ＤＮＡの合成のためにＨ鎖複製中に生み出される、電子顕微鏡下で可視の、およそ１１００塩基対を含むノンコーディングｍｔＤＮＡの領域のことを言う。
【００３５】
本明細書において使用される「ＮＤ１」、または「ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１」、または「ＮＤ１ｍｔ」という用語は、タンパク質ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１またはＮＤ１をコードするミトコンドリアゲノムの中に局在する遺伝子のことを言う。ヒトのＮＤ１遺伝子配列は、ジェンバンクデータベース（２０１４年１月２日版）に、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １の下で寄託されている。ＮＤ１タンパク質は、ミトコンドリアの中で活性化され、酸化的リン酸化のプロセスに含まれる、複合体Ｉと呼ばれる酵素複合体の一部である。
【００３６】
本明細書において使用される「ＣｐＧサイト」という用語は、塩基の直線的な配列においてその長さに沿ってシトシンヌクレオチドの後にグアニンヌクレオチドが続くＤＮＡ領域、特にミトコンドリアＤＮＡ領域のことを言う。「ＣｐＧ」は、「Ｃ−リン酸−Ｇ」、すなわち、リン酸のみによって隔てられたシトシンおよびグアニンのための省略形であり、リン酸は、ＤＮＡにおける任意の２つのヌクレオシドを共に結合する。「ＣｐＧ」という用語は、この直線的な配列をグアニンおよびシトシンのＣＧ塩基対合と区別するために使用される。ＣｐＧジヌクレオチドにおけるシトシンは、メチル化されて５−メチルシトシンを形成し得る。
【００３７】
本明細書において使用される「ＣＨＧサイト」という用語は、シトシンヌクレオチドおよびグアニンヌクレオチドがアデニン、シトシン、またはチミンであり得る可変ヌクレオチド（Ｈ）によって隔てられているＤＮＡ領域、特にミトコンドリアＤＮＡ領域のことを言う。ＣＨＧサイトのシトシンは、メチル化されて５−メチルシトシンを形成し得る。
【００３８】
本明細書において使用される「ＣＨＨサイト」という用語は、シトシンヌクレオチドの後にアデニン、シトシン、またはチミンであり得る第１および第２の可変ヌクレオチド（Ｈ）が続くＤＮＡ領域、特にミトコンドリアＤＮＡの領域のことを言う。ＣＨＧサイトのシトシンは、メチル化されて５−メチルシトシンを形成し得る。
【００３９】
特定の実施形態において、発明の第１の方法は、ミトコンドリアＤＮＡを備える被験者のサンプルにおいて、表１において示されたサイトから選択されたＤ−ループ領域のＣｐＧサイトから選択された少なくとも１つのサイトにおけるメチル化パターンを決定することを備える。
【００４０】
【表１】

本明細書において使用される「ＣｐＧサイトにおけるメチル化パターンの決定」という用語は、特定のＣｐＧサイトのメチル化ステータスの決定のことを言う。ＣｐＧサイトのメチル化パターンの決定は、当業者に知られている複数のプロセスによって行われ得る。
【００４１】
特定の実施形態において、発明の第１の方法は、表１において示されたサイトから選択されたＤ−ループ領域における少なくとも１つのＣｐＧサイトのメチル化パターンを決定することを含む。別の特定の実施形態において、発明の第１の方法は、表１から選択された、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、少なくとも１４個の、少なくとも１５個の、または少なくとも１６個のＣｐＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００４２】
発明のさらに一層特定のおよび好ましい実施形態において、発明の第１の方法は、表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトのすべてのメチル化パターンを決定することを備える。
【００４３】
別の特定の実施形態において、発明の第１の方法は、ミトコンドリアＤＮＡを含む被験者のサンプルにおいて、表２において示されたＮＤ１遺伝子のＣｐＧサイトから選択された少なくとも１つのサイトにおけるメチル化パターンを決定することを備える。
【００４４】
【表２】

別の特定の実施形態において、発明の第１の方法は、表２において示されたＮＤ１遺伝子から選択されたＣｐＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。別の特定の実施形態において、発明の第１の方法は、表２から選択された、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つのＣｐＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００４５】
発明のさらに一層特定のおよび好ましい実施形態において、発明の第１の方法は、表２において示されたＮＤ１遺伝子のＣｐＧサイトのすべてにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００４６】
別の特定の実施形態において、発明の第１の方法は、ミトコンドリアＤＮＡを備える被験者のサンプルにおいて、表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトから選択された少なくとも１つのサイトにおけるメチル化パターンを決定することを備える。
【００４７】
【表３】

本明細書において使用される「ＣＨＧサイトにおけるメチル化パターンの決定」という用語は、特定のＣＨＧサイトのメチル化ステータスの決定のことを言う。
【００４８】
ＣＨＧサイトのメチル化パターンの決定は、当業者に知られている複数のプロセスによって行われ得る。
【００４９】
特定の実施形態において、発明の第１の方法は、表３において示されたサイトから選択されたＤ−ループ領域の少なくとも１つのＣＨＧサイトのメチル化パターンを決定することを含む。別の特定の実施形態において、発明の第１の方法は、表３から選択された、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、または少なくとも１４個の、または少なくとも１５個のＣＨＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００５０】
発明のさらに一層特定のおよび好ましい実施形態において、発明の第１の方法は、表３において示されたＤ−ループ領域のＣＨＧサイトのすべてにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００５１】
別の特定の実施形態において、発明の第１の方法は、ミトコンドリアＤＮＡを備える被験者のサンプルにおいて、表４において示されたＮＤ１遺伝子のＣＨＧサイトから選択された少なくとも１つのサイトにおけるメチル化パターンを決定することを備える。
【００５２】
【表４】

別の特定の実施形態において、発明の第１の方法は、表４において示されたサイトから選択されたＮＤ１遺伝子における少なくとも１つのＣＨＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。別の特定の実施形態において、発明の第１の方法は、表４から選択された、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つのＣＨＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを備える。
【００５３】
発明のさらに一層特定のおよび好ましい実施形態において、発明の第１の方法は、表４において示されたＮＤ１遺伝子のＣＨＧサイトのすべてにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００５４】
別の特定の実施形態において、発明の第１の方法は、ミトコンドリアＤＮＡを備える被験者のサンプルにおいて、表５において示されたＣＨＨサイトから選択されたＤ−ループ領域のＣＨＨサイトから選択された少なくとも１つのサイトにおけるメチル化パターンを決定することを備える。
【００５５】
【表５】

本明細書において使用される「ＣＨＨサイトにおけるメチル化パターンの決定」という用語は、特定のＣＨＨサイトのメチル化ステータスを決定することを言う。ＣＨＧサイトのメチル化パターンの決定は、当業者に知られている複数のプロセスによって行われ得る。
【００５６】
別の特定の実施形態において、発明の第１の方法は、表５において示されたものから選択されたＤ−ループ領域の少なくとも１つのＣＨＨサイトにおけるメチル化パターンを決定することを備える。別の特定の実施形態において、発明の第１の方法は、表５から選択された、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、少なくとも１４個の、少なくとも１５個の、少なくとも１６個の、少なくとも１７個の、少なくとも１８個の、少なくとも１９個の、少なくとも２０個の、少なくとも２１個の、少なくとも２２個の、少なくとも２３個の、少なくとも２４個の、少なくとも２５個の、少なくとも２６個の、少なくとも２７個の、少なくとも２８個の、少なくとも２９個の、少なくとも３０個の、少なくとも３１個の、少なくとも３２個の、少なくとも３３個の、少なくとも３４個の、少なくとも３５個の、少なくとも３６個の、少なくとも３７個の、少なくとも３８個の、少なくとも３９個の、少なくとも４０個の、少なくとも４１個の、少なくとも４２個の、または少なくとも４３個のＣＨＨサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００５７】
発明のさらに一層特定のおよび好ましい実施形態において、発明の第１の方法は、表５上に示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイトのすべてにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００５８】
実施形態の好ましい方法において、発明の第１の方法は、
（ｉ）表１において示されたＤ−ループ領域のＣｐＧサイトのすべて、および表２において示されたＮＤ１遺伝子のすべてのＣｐＧサイトにおける、メチル化のパターンの決定、
（ｉｉ）表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトのすべてにおける、および表３において示されたＤ−ループ領域のＣＨＧサイトのすべてにおける、メチル化パターンの決定、
（ｉｉｉ）表１において示されたＤ−ループ領域のＣｐＧサイトのすべて、および表４において示されたＮＤ１遺伝子のすべてのＣＨＧサイトにおける、メチル化パターンの決定、
（ｉｖ）表１において示されたＤ−ループ領域におけるすべてのＣｐＧサイトにおける、および表５において示されたＤ−ループ領域におけるすべてのＣＨＨサイトにおける、メチル化パターンの決定、
（ｖ）表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイトのすべてにおける、および表３上に示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトのすべてにおける、メチル化パターンの決定、
（ｖｉ）表２において示されたＮＤＩ遺伝子におけるＣｐＧサイトのすべてにおける、および表４において示されたＮＤＩ遺伝子におけるＣＨＧサイトのすべてにおける、メチル化パターンの決定、
（ｖｉｉ）表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイトのすべてにおける、および表５において示されたＤ−ループ領域のＣＨＨサイトのすべてにおける、メチル化パターンの決定、
（ｖｉｉｉ）表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトのすべて、および表４において示されたＮＤ１遺伝子のすべてのＣＨＧサイトにおける、メチル化パターンの決定、
（ｉｘ）表３において示されたＤ−ループ領域におけるすべてのＣＨＧサイトにおけるメチル化パターンの決定、および／または
（ｘ）表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイトのすべてにおける、および表５におけるＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイトのすべてにおける、メチル化パターンの決定を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態において、発明の第１の方法に係る、少なくとも１つのＣｐＧサイト、少なくとも１つのＣＨＧサイト、および／または少なくとも１つのＣＨＨサイトにおけるメチル化パターンの決定は、全血サンプルにおいて実行され、そのケースでは、決定が直接的になされ得る。他の実施形態では、最初の段階として、ミトコンドリアＤＮＡを含むサンプル、好ましくはトータルＤＮＡのサンプルが、生物流体（たとえば、全血、脳脊髄液）中に存在する細胞から抽出され、そのようなケースでは、これらのサンプルから抽出されたトータル核酸が、後の解析のための適切な作業材料を表す。トータルＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡの分離は、（先に引用された）当業者に知られている従来の方法によって行われ得る。ミトコンドリアＤＮＡを含む核酸を分離し、（必要であれば）増幅した後、１つ以上のＣｐＧサイト、１つ以上のＣＨＧサイト、および／または１つ以上のＣＨＨサイトのメチル化パターンが決定される。当業者は、本明細書において説明される、被験者のミトコンドリアＤＮＡにおけるＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイトの１つまたはいくつかにおいて存在するメチル化パターンの解析は、そのようなサイトにおいて存在するメチル化パターンを測定できる任意の方法または技法によって実行され得る、ということを容易に認識するだろう。
【００６０】
別の特定の実施形態において、発明の第１の方法は、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、濃縮に基づいた方法（たとえば、ＭｅＤＩＰ、ＭＢＤ−ｓｅｑ、およびＭｅｔｈｙｌＣａｐ）、バイサルファイトシークエンシング、およびバイサルファイトに基づいた方法（たとえば、ＲＲＢｓ、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ、Ｃｏｂｒａ、ＭＳＰ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ）を通じて、および制限消化による方法（たとえば、ＭＲＥ−ｓｅｑ、またはＨＥＬＰ ｔｒｉａｌ）、パイロシークエンシング、または、メチル化されたＤＮＡのＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイトの差別的変換、差別的制限、差別的重みからなるグループから選択された技法によって、前記ＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００６１】
発明の特定のおよび好ましい実施形態において、Ｄ−ループ領域における１つ以上のＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイト、および／または、ＮＤ１遺伝子における１つ以上のＣｐＧおよび／またはＣＨＧサイトのメチル化パターンは、パイロシークエンシングによって決定される。簡潔には、この技法は、ＤＮＡ合成中の放出されたピロリン酸塩（ＰＰｉ）の合成と検出によるシークエンシングの原理に基づく。この技法は、合成プロセス中に核酸配列を検出するための一連の４つの酵素、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼと、基質として使用されるアデノシン５’ホスホ硫酸（ＡＰＳ）およびルシフェリンを用いる。
【００６２】
ミトコンドリアＤＮＡにおけるメチル化パターンを決定するために、すべての非メチル化シトシン塩基が、ウラシル塩基、または、塩基対合挙動の観点でシトシンとは異なる別の塩基で変更される一方で、５メチルシトシンの塩基が変化しないままであるよう、前記サンプルを化学的に処理することが必要である。本明細書において使用される「変更する」という用語は、非メチル化シトシンをメチル化されたシトシンと区別するであろう別のヌクレオチドへの、非メチル化シトシンの変換を意味する。ミトコンドリアＤＮＡを含むサンプルにおける、メチル化ではなく非メチル化シトシン塩基の変換は、変換薬剤を用いて実行される。本明細書において使用される「変換薬剤」または「変換試薬」という用語は、非メチル化シトシンを、ウラシル、または、ハイブリダイゼーション特性の観点でシトシンとは差別的に検出可能な別の塩基へと変換することができる試薬のことを言う。変換薬剤は、好ましくは、バイサルファイトまたは亜硫酸水素塩といった重硫酸塩である。しかしながら、非メチル化シトシンを同様に変更するが、メチル化されたシトシンはしない他の薬剤、たとえば、亜硫酸水素塩もまた、発明のこの方法において使用され得る。反応は、標準的な手順にしたがって行われる（Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１８２７−１８３１、Ｏｌｅｋ，１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５０６４−６、欧州特許第１３９４１７２号明細書）。酵素によって、たとえば、メチル化特異的シチジンデアミナーゼを使用して、変換を実行することもまた、可能である。
【００６３】
発明の第１の方法の好ましい実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡを含むサンプルは、非メチル化シトシンをウラシルまたはハイブリダイゼーション特性の観点でシトシンとは検出可能に異なる別の塩基へと変換することができる試薬により、処理されている。より好ましい実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡを備えるサンプルは、適切な市販のキット、たとえば、「ＥＺ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｃｏｇｅｎ；Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）を使用してバイサルファイトにより処理される。
【００６４】
ミトコンドリアＤＮＡを含むサンプルがバイサルファイトによって処理されると、表１から５において示された１つ以上のＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイトを含むＤ−ループ領域および／またはＮＤ１遺伝子は、非メチル化配列（ＣｐＧサイトのシトシンがウラシルへと変換されている）をメチル化された配列（ＣｐＧサイトにおけるシトシンがシトシンとして残っている）と区別するプライマーを使用して増幅され得る。多くの増幅方法は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、リガーゼ連鎖反応ポリメラーゼ３５、ギャップ−ＬＣＲ、修復連鎖反応、３ＳＲ、およびＮＡＳＢＡといった、酵素連鎖反応に依拠する。さらに、鎖変位増幅（ＳＤＡ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、およびＱβ−増幅、等が存在するが、これは単なる例示的なリストである。核酸増幅の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１（先に引用）において説明されている。他の増幅方法は、バイサルファイト処理と対立遺伝子特異的ＰＣＲ（たとえば、米国特許第５，１３７，８０６号明細書、米国特許第５，５９５，８９０号明細書、米国特許第５，６３９，６１１号明細書を参照）を組み合わせた、米国特許第５，７８６，１４６号明細書において説明されているメチル化特異的ＰＣＲ方法（ＭＳＰ）を含む。ウラシルはＴａｑポリメラーゼによりチミンとして認識されるので、ＰＣＲによると、結果として生じる産物は、開始テンプレートにおいて５−メチルシトシンＤＮＡが存在する位置でのみシトシンを含む。
【００６５】
発明の好ましい実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡを備えるサンプル、好ましくはトータルＤＮＡのサンプルが、バイサルファイトによって処理されると、１つ以上のＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイト（単数または複数）を含む領域は、メチル化された配列に特異的でないプライマーを使用して増幅され得る。たとえば、プライマーの好ましい配列は、ＣｐＧジヌクレオチドを備えるヌクレオチド配列に対応しない。
【００６６】
増幅産物は、従来技術における標準的な手順にしたがって検出される。増幅された核酸は、当業者に知られ、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１（先に引用）において説明される方法により、決定され得る。ターゲットの核酸が検出される前の追加の精製ステップ、たとえば、沈殿ステップもまた存在し得る。検出方法は、二本鎖ＤＮＡにインターカレートし、その後にその蛍光性を変化させる、臭化エチジウムのような特定の染料の結合またはインターリーブを含み得るが、これに限定されないことができる。精製された核酸はまた、オプションで制限消化の後に電気泳動法により切り離され得、後に表示され得る。特定の配列へのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションと後続のハイブリッド検出とを利用する、プローブに基づいたアッセイもまた存在する。当業者に知られているさらなるステップの後にターゲットの核酸をシークエンシングすることもまた、可能である。他の方法は、特定のプローブが結合され、相補的配列が結合した場合に信号を生成する、シリコンチップとともに、さまざまな核酸配列を使用する。
【００６７】
発明の好ましい実施形態において、（たとえば、Ｄ−ループ領域における、またはＮＤ１遺伝子における）メチル化パターンを決定することが所望される関心の領域の増幅後、前記配列においてバイサルファイトによる処理後の変更されたＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイトを決定するために、パイロシークエンシングが使用される。サイトの各々におけるシトシン／チミンのための推論が、配列の伸長ステップ中に組み込まれるシトシンおよびチミンの量に基づいて量的に決定され得る。
【００６８】
あるいは、Ｄ−ループ領域における少なくとも１つのＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイトの、またはサイトのＮＤ１遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧおよび／またはＣＨＧサイトにおける、メチル化パターンは、制限酵素消化とサザンブロット解析とによって確認され得る。使用され得るエンドヌクレアーゼメチル化感受性制限酵素の例は、たとえば、Ｓｍａｌ、ＳａｃＩＩ、ＥａｇＩ、ＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩ、ＢｓｔＵＩ、およびＢｓｓＨＩＩを含む。
【００６９】
本明細書において使用される「ハイパーメチル化」という用語は、１つ以上のヌクレオチド、好ましくはＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイトからのシトシンが、参照サンプルと比較してメチル化されている、変質したメチル化パターンのことを言う。前記参照サンプルは、好ましくは、ＡＤまたはＰＤから選択された神経変性疾患に罹患していない被験者から得られたミトコンドリアＤＮＡを含むサンプルである。特に用語は、ミトコンドリアＤＮＡの配列における、表１において示されたＤ−ループ領域における１つ以上のＣｐＧサイト、表２において示されたＮＤ１遺伝子における１つ以上のＣｐＧサイト、表３において示されたＤ−ループ領域における１つ以上のＣＨＧサイト、表４において示されたＮＤ１遺伝子における１つ以上のＣＨＧサイト、および／または表５において示されたＤ−ループ領域における１つ以上のＣＨＨサイトにおける、参照サンプルにおける前記１つ以上のサイトにおいて存在する５−メチルシトシンの相対的な量と比較された場合の、より多数の５−メチルシトシンのことを言う。
【００７０】
本明細書において使用される「ハイポメチル化」という用語は、１つ以上のヌクレオチド、好ましくはＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイトにおけるシトシンが、参照サンプルと比較してメチル化されていない、変質したメチル化パターンのことを言う。「参照サンプル」という用語は、ＡＤまたはＰＤから選択された神経変性疾患に罹患していない被験者から得られたミトコンドリアＤＮＡを含むサンプルのことを言う。特に前記用語は、ミトコンドリアＤＮＡの配列における、表１において示されたＤ−ループ領域における１つ以上のＣｐＧサイト、表２において示されたＮＤ１遺伝子の１つ以上のＣｐＧサイト、表３において示されたＤ−ループ領域における１つ以上のＣＨＧサイト、表４において示されたＮＤ１遺伝子における１つ以上のＣＨＧサイト、および／または表５において示されたＤ−ループ領域における１つ以上のＣＨＨサイトにおける、参照サンプルにおける前記１つ以上のＣｐＧサイト、１つ以上のＣＨＧサイト、および／または１つ以上のＣＨＨサイトにおいて存在する５−メチルシトシンの相対的な量と比較された場合の、少数の５−メチルシトシンのことを言う。
【００７１】
発明の好ましい実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡを含む前記参照サンプルは、組織サンプル、または生物流体、好ましくは被験者の血液サンプルもしくは脳脊髄液から選択される。好ましい実施形態において、前記参照サンプルは、トータルＤＮＡである。これらのサンプルを得るための方法、ならびに、サンプルのトータルＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡを分離する方法は、上に詳述されている。さらに一層好ましい実施形態において、参照サンプルは、年齢が一致した被験者からのミトコンドリアＤＮＡを含むサンプルである。
【００７２】
この第１の方法において、発明は、アルツハイマー病およびパーキンソン病から選択された神経変性疾患の発病の診断またはリスクに関連する、いくつかの特定のＣｐＧ、ＣＨＨ、およびＣＨＧサイトを提供する。したがって、
−表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、
−表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、
−表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、
−表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、および／または
−表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化は、被験者がアルツハイマー病に罹患していること、または被験者がアルツハイマー病を発病する高いリスクにあることを示し、または、
−表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、
−表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、および／または
−表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化は、被験者がパーキンソン病に罹患していること、または被験者がパーキンソン病を発病する高いリスクにあることを示す。
【００７３】
特定の実施形態において、発明の第１の方法は、表１、３、および５において示されたＤ−ループ領域におけるすべてのＣｐＧサイト、すべてのＣＨＧサイト、およびすべてのＣＨＨサイトのメチル化パターンと、表２および４において示されたＮＤ１遺伝子のすべてのＣｐＧサイトおよびすべてのＣＨＧサイトのメチル化パターンとを決定することを含む。
【００７４】
本発明の著者は、Ｄ−ループ領域におけるＣｐＧ、ＣＨＧ、およびＣＨＨサイトにおけるメチル化の度合は、ステージＩ〜ＩＩにおけるアルツハイマー病に罹患している被験者のほうがステージＩＩＩ〜ＩＶにおける疾患に罹患している被験者よりも高い、ということを見出した。
【００７５】
特定の実施形態において、参照パターンに対するメチル化パターンが、アルツハイマー病のステージＩ〜ＩＩであると診断された被験者からのミトコンドリアＤＮＡを含むサンプルにおいて観察された場合には、表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、または表３において示されたＤ−ループ領域における前記ＣＨＧサイトの１つにおけるハイポメチル化は、被験者がアルツハイマー病のステージＩＩＩ〜ＩＶに罹患していることを示す。
発明の第２の方法
第２の態様において、発明は、被験者におけるアルツハイマー病およびパーキンソン病から選択された神経変性疾患の予防的治療を施行される被験者を選択するためのインビトロ法（以下、発明の第２の方法）に関し、この方法は、ミトコンドリアＤＮＡを含む前記被験者のサンプルにおいてＤ−ループ領域におけるおよび／またはＮＤ１遺伝子におけるメチル化パターンを決定することを含み、前記メチル化パターンは、
ｉ．表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイト、
ｉｉ．表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイト、
ｉｉｉ．表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイト、
ｉｖ．表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイト、および／または
ｖ．表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイト
によって形成されたグループから選択された少なくとも１つのサイトにおいて決定され、
Ｄ−ループ領域における前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、Ｄ−ループ領域における前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、Ｄ−ループ領域における前記ＣＨＨサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、ＮＤ１遺伝子における前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、および／またはＮＤ１遺伝子における前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化は、前記被験者がアルツハイマー病を予防することを目的とした治療を受ける候補であることを示し、または、
Ｄ−ループ領域における前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、Ｄ−ループ領域における前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、および／またはＤ−ループ領域における前記ＣＨＨサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、それは、前記被験者がパーキンソン病を予防することを目的とした治療を受ける候補であることを示す。
【００７６】
本明細書において使用される「予防的治療」という用語は、その症状の発症を予防するまたは遅らせるための、予防または疾患を予防するための防止策の併用、ならびに、その臨床症状の減少または緩和のことを言う。特に用語は、アルツハイマーおよびパーキンソン病から選択された神経変性疾患に関連づけられた臨床症状を遅らせるまたは軽減するための、予防または発生を予防するための策のセットのことを言う。被験者への治療の施与に関連づけられた所望の臨床成果は、疾患の病理学的ステージの安定化、疾患の進行を遅らせること、または被験者の生理学的状態の改善を含むが、これに限定されない。
【００７７】
アルツハイマー病の症状の発症を予防することまたは遅らせることを目的とした適切な予防的治療は、ドネペジル塩酸塩（アリセプト）、リバスチグミン（エクセロン）、およびガランタミン（レミニール）といった、コリンエステラーゼ阻害薬、または拮抗薬のＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）を含むが、これに限定されない。パーキンソン病の症状の発症を予防することまたは遅らせることを目的とした治療は、Ｌ−ドパ、トルカポン（タスマール）およびエンタカポン（コムタン）といったカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）の阻害薬、セレギリン（エルデプリル）およびラサギリン（アジレクト）といったモノアミン酸化酵素Ｂ（ＭＡＯＢ）、およびプラミペキソール、ロチゴチン、およびロピニロールといったドーパミンアゴニストを含むが、これに限定されない。
【００７８】
本明細書において使用される「選択」という用語は、アルツハイマー病およびパーキンソン病から選択された神経変性疾患の予防的治療の施行のために被験者を選定する行為のことを言う。
【００７９】
「被験者」、「神経変性疾患」、「アルツハイマー病」、「パーキンソン病」、「サンプル」、「ミトコンドリアＤＮＡ」、「Ｄ−ループ領域」、「ＮＤ１遺伝子」、「ＣｐＧサイト」、「ＣＨＧサイト」、「ＣＨＨサイト」、「メチル化パターン」、「ハイパーメチル化」、および「ハイポメチル化」という用語は、発明の第１の方法の文脈において詳細に説明されており、発明の第２の方法において同一の意味で使用される。
【００８０】
発明の第２の方法の特定の実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡを備えるサンプルは、固体組織のバイオプシーまたは生物流体から選択される。サンプルは、当業者に知られている従来の方法によって得られうる。
【００８１】
より一層特定の実施形態において、生物流体は、末梢血または脳脊髄液から選択される。
【００８２】
より一層特定の実施形態において、前記固体組織は、脳組織である。発明の好ましい実施形態において、パーキンソン病の予防的治療を施行される被験者を選択することが所望される場合、前記サンプルは、黒質から得られた脳組織サンプルである。
【００８３】
特定の実施形態において、発明の第２の方法は、ミトコンドリアＤＮＡを含む被験者のサンプルにおいて、表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトから選択された少なくとも１つのサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００８４】
特定の実施形態において、発明の第２の方法は、表１において示されたものから選択されたＤ−ループ領域における少なくとも１つのＣｐＧサイトにおけるメチル化パターンの決定を含む。別の特定の実施形態において、発明の第１の方法は、表１から選択された、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、少なくとも１４個の、少なくとも１５個の、または少なくとも１６個のＣｐＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００８５】
発明のさらに一層特定のおよび好ましい実施形態において、発明の第２の方法は、表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトのすべてにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００８６】
別の特定の実施形態において、発明の第２の方法は、ミトコンドリアＤＮＡを備える被験者のサンプルにおいて、表２において示されたＮＤ１遺伝子のＣｐＧサイトから選択された少なくとも１つのサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００８７】
別の特定の実施形態において、発明の第２の方法は、表２において示されたサイトから選択されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。別の特定の実施形態において、発明の第２の方法は、表２から選択された、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つのＣｐＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００８８】
発明のさらに一層特定のおよび好ましい実施形態において、発明の第２の方法は、表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイトのすべてのメチル化パターンを決定することを含む。
【００８９】
別の特定の実施形態において、発明の第２の方法は、ミトコンドリアＤＮＡを含む被験者のサンプルにおいて、表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトから選択された少なくとも１つのサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００９０】
特定の実施形態において、発明の第２の方法は、表３において示されたサイトから選択されたＤ−ループ領域における少なくとも１つのＣＨＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。別の特定の実施形態において、発明の第２の方法は、表３から選択された、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、または少なくとも１４個の、または少なくとも１５個のＣＨＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００９１】
発明のさらに一層特定のおよび好ましい実施形態において、発明の第２の方法は、表３において示されたＤ−ループ領域におけるすべてのＣＨＧサイトのメチル化パターンを決定することを含む。
【００９２】
別の特定の実施形態において、発明の第２の方法は、ミトコンドリアＤＮＡを含む被験者のサンプルにおいて、表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイトから選択された少なくとも１つのサイトにおけるメチル化パターンの決定を含む。
【００９３】
別の特定の実施形態において、発明の第２の方法は、表４において示されたサイトから選択されたＮＤ１遺伝子における少なくとも１つのＣＨＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。別の特定の実施形態において、発明の第２の方法は、表４から選択された、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つのＣｐＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００９４】
発明のさらに一層特定のおよび好ましい実施形態において、発明の第２の方法は、表４において示されたＮＤ１遺伝子のＣＨＧサイトのすべてにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００９５】
別の特定の実施形態において、発明の第２の方法は、ミトコンドリアＤＮＡを含む被験者のサンプルにおいて、表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイトから選択された少なくとも１つのサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００９６】
別の特定の実施形態において、発明の第２の方法は、表５において示されたものから選択されたＤ−ループ領域における少なくとも１つのＣＨＨサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。別の特定の実施形態において、発明の第２の方法は、表５から選択された、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、少なくとも１４個の、少なくとも１５個の、少なくとも１６個の、少なくとも１７個の、少なくとも１８個の、少なくとも１９個の、少なくとも２０個の、少なくとも２１個の、少なくとも２２個の、少なくとも２３個の、少なくとも２４個の、少なくとも２５個の、少なくとも２６個の、少なくとも２７個の、少なくとも２８個の、少なくとも２９個の、少なくとも３０個の、少なくとも３１個の、少なくとも３２個の、少なくとも３３個の、少なくとも３４個の、少なくとも３５個の、少なくとも３６個の、少なくとも３７個の、少なくとも３８個の、少なくとも３９個の、少なくとも４０個の、少なくとも４１個の、少なくとも４２個の、または少なくとも４３個のＣＨＨサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００９７】
発明のさらに一層特定のおよび好ましい実施形態において、発明の第２の方法は、表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイトのすべてにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【００９８】
実施形態の好ましい方法において、発明の第２の方法は、
（ｉ）表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトのすべてにおける、および表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイトのすべてにおける、メチル化パターンの決定、
（ｉｉ）表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトのすべてにおける、および表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトのすべてにおける、メチル化パターンの決定、
（ｉｉｉ）表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトのすべてにおける、および表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイトのすべてにおける、メチル化パターンの決定、
（ｉｖ）表１において示されたＤ−ループ領域におけるすべてのＣｐＧサイトにおける、および表５において示されたＤ−ループ領域におけるすべてのＣＨＨサイトにおける、メチル化パターンの決定、
（ｖ）表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイトのすべてにおける、および表３において示されたＤ−ループ領域におけるすべてのＣＨＧサイトにおける、メチル化パターンの決定、
（ｖｉ）表２において示されたＮＤＩ遺伝子におけるＣｐＧサイトのすべてにおける、および表４において示されたＮＤＩ遺伝子におけるＣＨＧサイトのすべてにおける、メチル化パターンの決定、
（ｖｉｉ）表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるすべてのＣｐＧサイトにおける、および表５において示されたＤ−ループ領域におけるすべてのＣＨＨサイトにおける、メチル化パターンの決定、
（ｖｉｉｉ）表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトのすべてにおける、および表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイトのすべてにおける、メチル化パターンの決定、
（ｉｘ）表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトのすべてにおけるメチル化パターンの決定、および／または
（ｘ）表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイトのすべてにおける、および表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイトのすべてにおける、メチル化パターンの決定を含む。
【００９９】
ミトコンドリアＤＮＡを含む被験者のサンプルにおけるメチル化パターンを決定するための適切な方法は、発明の第１の方法の文脈において詳細に説明されている。
【０１００】
特定の実施形態において、発明の第２の方法は、メチル化特異的ＰＣＲ、濃縮に基づいた方法（たとえば、ＭｅＤＩＰ、ＭＢＤ−ｓｅｑ、およびＭｅｔｈｙｌＣａｐ）、バイサルファイトシークエンシング、およびバイサルファイトに基づいた方法（たとえば、ＲＲＢｓ、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ、Ｃｏｂｒａ、ＭＳＰ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ）、および制限消化のための方法（たとえば、ＭＲＥ−ｓｅｑ、またはＨＥＬＰ ｔｒｉａｌ）、パイロシークエンシング、アッセイＣｈＩＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ、または、メチル化されたＤＮＡのＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイトの差別的変換、差別的制限、差別的重みからなるグループから選択された技法によって、前記ＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【０１０１】
発明の特定のおよび好ましい実施形態において、Ｄ−ループ領域における１つ以上のＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイト、および／または、ＮＤ１遺伝子における１つ以上のＣｐＧまたはＣＨＨサイトの、メチル化パターンは、発明の第２の方法によると、パイロシークエンシングによって決定される。
【０１０２】
発明の第２の方法によると、
−表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、
−表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、
−表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、
−表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、
−および／または表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化は、被験者がアルツハイマー病を予防することを目的とした治療を受ける候補であることを示し、または、
−表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、
−表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、
−および／または表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化は、被験者がパーキンソン病を予防することを目的とした治療を受ける候補であることを示す。
【０１０３】
特定の実施形態において、発明の第２の方法は、表１、３、および５において示されたＤ−ループ領域におけるすべてのＣｐＧサイト、すべてのＣＨＧサイト、およびＣＨＨサイトのすべてのメチル化パターンと、表２および４において示されたＮＤ１遺伝子におけるすべてのＣｐＧサイトおよびＣＨＧサイトのすべてのメチル化パターンとを決定することを含む。
発明の第３の方法
第３の特徴において、発明は、被験者におけるアルツハイマーまたはパーキンソン病から選択された神経変性疾患の進行を監視するためのインビトロ法（以下、発明の第３の方法）に関し、この方法は、
（ａ）ミトコンドリアＤＮＡを含む前記被験者からのサンプルにおける、Ｄ−ループ領域におけるおよび／またはＮＤ１遺伝子におけるメチル化パターンの決定であって、前記メチル化パターンは、
（ｉ）表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイト、
（ｉｉ）表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイト、
（ｉｉｉ）表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイト、
（ｉｖ）表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイト、および／または
（ｖ）表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイト
によって形成されたグループから選択された少なくとも１つのサイトで決定されることと、
（ｂ）ステップａ）において決定されたメチル化パターンを前記疾患のより早いステージにおいて得られた前記メチル化パターンと比較することとを含み、疾患のより早いステージで決定された前記メチル化パターンに対する、Ｄ−ループ領域における前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、Ｄ−ループ領域における前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、Ｄ−ループ領域における前記ＣＨＨサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、ＮＤ１遺伝子の前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、および／またはＮＤ１遺伝子における前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化のケースでは、アルツハイマー病の発達を示し、疾患のより早いステージで決定された前記メチル化パターンに対する、Ｄ−ループ領域における前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、Ｄ−ループ領域における前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、および／またはＤ−ループ領域における前記ＣＨＨサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化が存在し、パーキンソン病の発達を示す。
【０１０４】
「予後を決定する」と同等である「進行を監視する」という用語は、疾患であると診断された被験者における前記疾患の進行を決定することを言う。特に用語は、アルツハイマー病およびパーキンソン病から選択された神経変性疾患であると診断された被験者における前記疾患の進行を決定することを言う。当業者が知っている通り、被験者における疾患の評価を決定するためのいくつかの適切なパラメータが存在し、たとえば、ＡＤおよびＰＤから選択された神経変性疾患の評価は、全生存の決定によって決定され得る。
【０１０５】
特定の実施形態において、研究対象の被験者は、ＡＤのステージＩ〜ＩＩであると診断されている。
【０１０６】
別の特定の実施形態において、研究対象の被験者は、ステージＩＩＩ〜ＶにおけるＰＤであると診断されている。
【０１０７】
本明細書において使用される「全生存」という用語は、アルツハイマーおよびパーキンソン病から選択された神経変性疾患の診断または治療時から、定義された時間期間後に生存する患者のパーセンテージのことを言う。
【０１０８】
「被験者」、「神経変性疾患」、「アルツハイマー病」、「パーキンソン病」、「サンプル」、「ミトコンドリアＤＮＡ」、「Ｄ−ループ領域」、「ＮＤ１遺伝子」、「ＣｐＧサイト」、「ＣＨＧサイト」、「ＣＨＨサイト」、「メチル化パターン」、「ハイパーメチル化」、および「ハイポメチル化」という用語は、発明の第１の方法の文脈において詳細に説明されており、発明の第３の方法において同一の意味で使用される。
【０１０９】
発明の第３の方法によると、ＡＤおよびＰＤから選択された神経変性疾患の予後を決定する第１のステップは、前記神経変性疾患であると診断された被験者からのミトコンドリアＤＮＡを含むサンプルにおいて、表１から５において示されたサイトから選択された少なくとも１つのサイトにおけるＤ−ループ領域におけるおよび／またはＮＤ１遺伝子におけるメチル化パターンを決定することを含む。
【０１１０】
第２のステップにおいて、発明の第３の方法は、前記第１のステップにおいて得られたメチル化パターンを、疾患のより早いステージにおいて得られた前記メチル化パターンと比較することを含む。したがって、発明の第３の方法は、前記神経変性疾患であると診断された被験者からのミトコンドリアＤＮＡを含むサンプル（第１のサンプル）におけるメチル化パターン、表１から５において示されたＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイトから選択された少なくとも１つのサイトにおけるＤループ領域におけるおよび／またはＮＤ１遺伝子におけるメチル化パターンを決定することと、適切な時間期間後に、前記神経変性疾患であると診断された前記被験者のミトコンドリアＤＮＡを含むサンプル（第２のサンプル）において、これらのサイトでのメチル化パターンを決定することとを含む。前記第２のサンプルは、第１のサンプルを得た後、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、１年、２年、３年、４年、５年、１０年、またはそれ以上の期間に得られうる。
【０１１１】
特定の実施形態において、前記第１のサンプルは、ＡＤおよびＰＤから選択された前記神経変性疾患のための任意の適切な治療を受けていない被験者から得られ、前記第２のサンプルは、疾患の治療が行われている時間期間後に得られる。別の特定の実施形態において、前記第１のサンプルは、前記神経変性疾患のための適切な治療の開始時に得られ、第２のサンプルは、治療の過程中の１つ以上のポイントで得られる。
【０１１２】
発明の第３の方法によると、
疾患のより早いステージで決定された前記メチル化パターンに対する、
−表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、
−表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、
−表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイトの少なくとも１つにおけるハイパーメチル化、
−表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、
−および／または表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化は、アルツハイマー病の発達を示し、または、
疾患のより早いステージで決定された前記メチル化パターンに対する、
−表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、
−表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化、
−および／または表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイトの少なくとも１つにおけるハイポメチル化は、パーキンソン病の発達を示す。
【０１１３】
本明細書において使用される「アルツハイマー病の発達」という表現は、被験者が、被験者が診断されたステージに対し、疾患のより進展したステージにあることをいう。すなわち、被験者が（その被験者において存在する脳の障害および／または疾患の症状もしくは臨床所見にしたがって）ＡＤのステージＩ〜ＩＩとして分類された場合、被験者は、被験者がステージＩＩＩ〜ＩＶもしくはステージＶ〜ＶＩでの分類から移行する場合、または、被験者がステージＩＩＩ〜ＩＶとしての分類からＡＤのステージＶ〜ＶＩとしての分類へと移行する場合、疾患のより発達したステージにあるとみなされる。
【０１１４】
本明細書において使用される「パーキンソン病の発達」という表現は、被験者が、被験者が診断されたステージに対し、疾患のより進展したステージにあることをいう。すなわち、被験者が（その被験者において存在する脳の障害および／または疾患の症状もしくは臨床所見にしたがって）ＰＤのステージＩ〜ＩＩとして分類された場合、被験者は、被験者がステージＩＩＩ〜ＩＶとしてのもしくはステージＶ〜ＶＩでの分類から移行する場合、または、被験者がステージＩＩＩ〜ＩＶとしての分類からＰＤのステージＶ〜ＶＩとしての分類へと移行する場合、疾患のより発達したステージにあるとみなされる。
【０１１５】
発明の第３の方法の特定の実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡを備えるサンプルは、固体組織のバイオプシーまたは生物流体から選択される。サンプルは、当業者に知られている従来の方法によって得られうる。
【０１１６】
より一層特定の実施形態において、生物流体は、末梢血または脳脊髄液から選択される。
【０１１７】
より一層特定の実施形態において、前記固体組織は、脳組織である。
【０１１８】
発明の好ましい実施形態において、パーキンソン病の進行が監視される場合、前記脳組織サンプルは、黒質から得られる。
【０１１９】
特定の実施形態において、発明の第３の方法は、ミトコンドリアＤＮＡを含む被験者のサンプルにおいて、表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトから選択された少なくとも１つのサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【０１２０】
特定の実施形態において、発明の第３の方法は、表１において示されたサイトから選択されたＤ−ループ領域における少なくとも１つのＣｐＧサイトのメチル化パターンを決定することを含む。別の特定の実施形態において、発明の第１の方法は、表１から選択された、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、少なくとも１４個の、少なくとも１５個の、または少なくとも１６個のＣｐＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【０１２１】
発明のさらに一層特定のおよび好ましい実施形態において、発明の第３の方法は、表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトのすべてのメチル化パターンを決定することを備える。
【０１２２】
別の特定の実施形態において、発明の第３の方法は、ミトコンドリアＤＮＡを含む被験者のサンプルにおいて、表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイトから選択された少なくとも１つのサイトにおけるメチル化パターンを決定することを備える。
【０１２３】
別の特定の実施形態において、発明の第３の方法は、表２において示されたサイトから選択されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【０１２４】
別の特定の実施形態において、発明の第３の方法は、表２から選択された、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つのＣｐＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【０１２５】
発明のさらに一層特定のおよび好ましい実施形態において、発明の第３の方法は、表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイトのすべてにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【０１２６】
特定の実施形態において、発明の第３の方法は、ミトコンドリアＤＮＡを含む被験者のサンプルにおいて、表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトから選択された少なくとも１つのサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【０１２７】
特定の実施形態において、発明の第３の方法は、表３において示されたサイトから選択されたＤ−ループ領域における少なくとも１つのＣＨＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。別の特定の実施形態において、発明の第３の方法は、表３から選択された、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、または少なくとも１４個の、または少なくとも１５個のＣＨＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【０１２８】
発明のさらに一層特定のおよび好ましい実施形態において、発明の第３の方法は、表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトのすべてにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【０１２９】
別の特定の実施形態において、発明の第３の方法は、ミトコンドリアＤＮＡを含む被験者のサンプルにおいて、表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイトから選択された少なくとも１つのサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【０１３０】
別の特定の実施形態において、発明の第３の方法は、表４において示されたサイトから選択されたＮＤ１遺伝子における少なくとも１つのＣＨＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。別の特定の実施形態において、発明の第３の方法は、表４から選択された、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つのＣｐＧサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【０１３１】
発明のさらに一層特定のおよび好ましい実施形態において、発明の第３の方法は、表４において示されたＮＤ１遺伝子のＣＨＧサイトのすべてにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【０１３２】
別の特定の実施形態において、発明の第３の方法は、ミトコンドリアＤＮＡを含む被験者のサンプルにおいて、表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイトから選択された少なくとも１つのサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【０１３３】
別の特定の実施形態において、発明の第３の方法は、表５において示されたサイトから選択されたＤ−ループ領域における少なくとも１つのＣＨＨサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。別の特定の実施形態において、発明の第３の方法は、表５から選択された、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、少なくとも１４個の、少なくとも１５個の、少なくとも１６個の、少なくとも１７個の、少なくとも１８個の、少なくとも１９個の、少なくとも２０個の、少なくとも２１個の、少なくとも２２個の、少なくとも２３個の、少なくとも２４個の、少なくとも２５個の、少なくとも２６個の、少なくとも２７個の、少なくとも２８個の、少なくとも２９個の、少なくとも３０個の、少なくとも３１個の、少なくとも３２個の、少なくとも３３個の、少なくとも３４個の、少なくとも３５個の、少なくとも３６個の、少なくとも３７個の、少なくとも３８個の、少なくとも３９個の、少なくとも４０個の、少なくとも４１個の、少なくとも４２個の、または少なくとも４３個のＣＨＨサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【０１３４】
発明のさらに一層特定のおよび好ましい実施形態において、発明の第３の方法は、表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイトのすべてにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【０１３５】
実施形態の好ましい方法において、発明の第３の方法は、
ｉ．表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトのすべてにおける、および表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイトのすべてにおける、メチル化パターンの決定、
ｉｉ．表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトのすべてにおける、および表３において示されたＤ−ループ領域のすべてのＣＨＧサイトにおける、メチル化パターンの決定、
ｉｉｉ．表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトのすべてにおける、および表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイトのすべてにおける、メチル化パターンの決定、
ｉｖ．表１において示されたＤ−ループ領域におけるすべてのＣｐＧサイトにおける、および表５において示されたＤ−ループ領域におけるすべてのＣＨＨサイトにおける、メチル化パターンの決定、
ｖ．表２において示されたＮＤ１遺伝子のすべてのＣｐＧサイトにおける、および表３において示されたＤ−ループ領域におけるすべてのＣＨＧサイトにおける、メチル化パターンの決定、
ｖｉ．表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイトのすべてにおける、および表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイトのすべてにおける、メチル化パターンの決定、
ｖｉｉ．表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるすべてのＣｐＧサイトにおける、および表５において示されたＤ−ループ領域におけるすべてのＣＨＨサイトにおける、メチル化パターンの決定、
ｖｉｉｉ．表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトのすべてにおける、および表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイトのすべてにおける、メチル化パターンの決定、および／または
ｉｘ．表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトのすべてにおけるメチル化パターンの決定、
ｘ．表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるすべてのＣＨＧサイトにおける、および表５において示されたＤ−ループ領域におけるすべてのＣＨＨサイトにおける、メチル化パターンの決定を含む。
【０１３６】
ミトコンドリアＤＮＡを含む被験者のサンプルにおけるメチル化パターンを決定するための適切な方法は、発明の第１の方法の文脈において詳細に説明されている。
【０１３７】
別の特定の実施形態において、発明の第３の方法は、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、濃縮に基づいた方法（たとえば、ＭｅＤＩＰ、ＭＢＤ−ｓｅｑ、およびＭｅｔｈｙｌＣａｐ）、バイサルファイトシークエンシング、およびバイサルファイトに基づいた方法（たとえば、ＲＲＢｓ、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ、Ｃｏｂｒａ、ＭＳＰ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ）を通じて、および制限消化による方法（たとえば、ＭＲＥ−ｓｅｑ、またはＨＥＬＰ ｔｒｉａｌ）、パイロシークエンシング、または、メチル化されたＤＮＡのＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイトの差別的変換、差別的制限、差別的重みからなるグループから選択された技法によって、前記ＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイトにおけるメチル化パターンを決定することを含む。
【０１３８】
発明の特定のおよび好ましい実施形態において、Ｄ−ループ領域における１つ以上のＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイト、および／または、ＮＤ１遺伝子における１つ以上のＣｐＧまたはＣＨＨサイトの、メチル化パターンは、発明の第３の方法によると、パイロシークエンシングによって決定される。
【０１３９】
別の特定の実施形態において、発明の第３の方法は、表１、３、および５において示されたＤ−ループ領域におけるすべてのＣｐＧサイト、すべてのＣＨＧサイト、およびすべてのＣＨＨサイトのメチル化パターンと、表２および４において示されたＮＤ１遺伝子におけるすべてのＣｐＧサイトおよびすべてのＣＨＧサイトのメチル化パターンとを決定することを含む。
発明の第４の方法
本発明の著者は、ミトコンドリアＤＮＡのＤ−ループ領域における一塩基多型（ＳＮＰ）であって、ＳＮＰが被験者のｍｔＤＮＡ分子の少なくとも６０％におけるものである場合にアルツハイマー病の発病に統計的に関連づけられるＳＮＰを発見した。
【０１４０】
したがって、第４の特徴において、発明は、被験者におけるアルツハイマー病を発病するリスクを診断または決定するためのインビトロ法（以下、発明の第４の方法）に関し、この方法は、前記被験者のミトコンドリアＤＮＡを含むサンプルにおいて、ＮＣＢＩデータベースにおいてアクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９でのヌクレオチドを決定することを含み、前記被験者のミトコンドリアＤＮＡ分子の少なくとも６０％における、前記多型位置でのヌクレオチドＣの検出または前記多型位置でのヌクレオチドＣの存在は、前記被験者が前記疾患に罹患していること、または、前記被験者が前記疾患を発病する高められたリスクを有することを示す。
【０１４１】
「診断」、「リスクを決定する」、「サンプル」、および「ミトコンドリアＤＮＡ」という用語は、発明の第１、第２、および第３の方法の文脈において定義されており、発明の第４の方法において同一の意味で使用される。
【０１４２】
多型位置での特定のヌクレオチドの存在は、サンプル中に存在する全ＤＮＡ分子に対する、前記多型位置でそのようなヌクレオチドを有するＤＮＡ分子のパーセンテージとして定義され得る。発明の第４の方法によると、被験者のｍｔＤＮＡが、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９でヌクレオチドＣを提示する場合、その位置で前記ヌクレオチドを提示する分子のパーセンテージが、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、またはそれ以上である場合、前記被験者がアルツハイマー病に罹患していること、または、前記被験者が前記疾患を発病する高められたリスクを有することが考えられる。
【０１４３】
特定の実施形態において、被験者のＭｔＤＮＡが、ｍｔＤＮＡ分子の６０％において、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９でヌクレオチドＣを提示する場合、前記被験者がアルツハイマー病を有すること、または、前記被験者が疾患を発病する高められたリスクを有することが考えられる。発明の好ましい実施形態において、被験者のＭｔＤＮＡが、ｍｔＤＮＡ分子の７１％において、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９でヌクレオチドＣを提示する場合、前記被験者がアルツハイマー病を有すること、または、前記被験者が前記疾患を発病する高められたリスクを有することが考えられる。
【０１４４】
発明の別の好ましい実施形態において、被験者からのｍｔＤＮＡが、ｍｔＤＮＡ分子の７４％において、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９でヌクレオチドＣを提示する場合、前記被験者がアルツハイマー病を有すること、または、前記被験者が疾患を発病する高いリスクにあることが考えられる。発明の好ましい実施形態において、被験者のＭｔＤＮＡが、ｍｔＤＮＡ分子の７８％において、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９でヌクレオチドＣを提示する場合、前記被験者がアルツハイマー病を有すること、または、前記被験者が前記疾患を発病する高いリスクにあることが考えられる。
【０１４５】
当業者が知っている通り、ミトコンドリアＤＮＡを含むサンプルは、ホモプラスミックまたはヘテロプラスミックであり得る。本明細書において使用される「ヘテロプラスミー」または「ヘテロプラスミックミトコンドリアＤＮＡ」という用語は、少なくとも２つの異なるミトコンドリア遺伝子型からのＤＮＡの混合からなる被験者のミトコンドリアＤＮＡのことを言う。本明細書において使用される「ホモプラスミア」または「ホモプラスミックミトコンドリアＤＮＡ」という用語は、単一のミトコンドリア遺伝子型からの単一のＤＮＡ遺伝子型によって形成された被験者のミトコンドリアＤＮＡのことを言う。
【０１４６】
特定の実施形態では、本発明の文脈において、ミトコンドリアＤＮＡのサンプルは、ホモプラスミックであり、そのケースでは、被験者において存在するすべてのミトコンドリアが同一の遺伝物質を含むので、被験者のすべてのミトコンドリアは、それらのゲノムにおいて、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９でヌクレオチドＣを提示する。ミトコンドリアＤＮＡのサンプルがホモプラスミックである実施形態において、発明の第４の方法は、前記ミトコンドリアＤＮＡサンプルにおいて、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９におけるＣヌクレオチドを検出することにより、被験者におけるアルツハイマー病を発病するリスクを診断または決定することを可能にし、すなわち、被験者からのホモプラスミックミトコンドリアＤＮＡのサンプルにおける、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９でのヌクレオチドＣの検出は、被験者がアルツハイマー病に罹患していること、または、被験者が疾患を発病する高められたリスクを有することを示す。逆に、ホモプラスミックミトコンドリアＤＮＡのサンプルにおける、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９でのヌクレオチドＴの検出は、被験者がアルツハイマー病に罹患していないこと、または、被験者が疾患を発病する低いリスクを有することを示す。
【０１４７】
発明の別の特定のおよび好ましい実施形態では、ミトコンドリアＤＮＡサンプルは、ヘテロプラスミックであり、すなわち、被験者のｍｔＤＮＡは、その遺伝物質が互いに同一でない２つのミトコンドリア母集団からのものである。本発明によると、ヘテロプラスミーとは、前記被験者の前記ミトコンドリアのうちのあるパーセンテージが、そのゲノムにおいて、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９でオリゴヌクレオチドＣを提示し、前記被験者のミトコンドリアの残りのパーセンテージは、そのゲノムにおいて、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９でオリゴヌクレオチドＴを提示する、という事実のことを言う。
【０１４８】
当業者は、ｍｔＤＮＡ分子の少なくとも６０％における多型の存在の同定が、アルツハイマー病の予防的治療の施行のための被験者を選択するために同様に有用であること、被験者のｍｔＤＮＡがヘテロプラスミーを提示するケースにおいて、被験者のｍｔＤＮＡがホモプラスミーを提示するケースのごとく分子全体が位置１６５１９でヌクレオチドＴまたはヌクレオチドＣを提示するケースでは、患者がアルツハイマー病のための予防的治療を受ける候補であることを示す多型を有するｍｔＤＮＡ分子のパーセンテージは、１００％または０％のいずれかであることを理解するだろう。そのように、そのｍｔＤＮＡがヘテロプラスミックである被験者のケースでは、位置１６５１９においてＴヌクレオチドを提示するＭｔＤＮＡ分子の母集団と、位置１６５１９においてＣヌクレオチドを提示する分子の第２の母集団とが存在するであろう。そのケースでは、位置１６５１９でヌクレオチドＣを提示するｍｔＤＮＡ分子のパーセンテージが６０％以上である場合、患者がアルツハイマー病の予防的治療のための候補であることが考えられる。
【０１４９】
ホモプラスミーおよびヘテロプラスミー、および、ヘテロプラスミーのパーセンテージまたは「ヘテロプラスミーの度合」の決定は、当業者によって知られている任意の技法によって決定され得る。ミトコンドリアＤＮＡのサンプルがヘテロプラスティックであるかどうかを決定することを可能にするための技法の非限定的で例示的な例は、ｍｔＤＮＡ配列のサザンブロットまたはＰＣＲ−ＲＦＬＰを含むが、これに限定されない。簡潔には、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ技法は、一般にサンプルにおけるＳＮＰの存在は、特異的配列すなわち１つ以上の制限酵素のターゲットの作製または分解に関連づけられる、という事実に基づいている。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ技法によるヘテロプラスミーの検出は、特異的なオリゴヌクレオチドを使用することによる検出されるべき多型を含む遺伝物質領域の増幅の第１の段階の後に、増幅された断片が適切な制限酵素の存在における酵素消化反応に曝される第２のステップが続く。サンプルにおける多型の存在または欠如は、ターゲットに特異的な制限パターンの存在または欠如に関連づけられるので、得られた断片サイズが、サンプルが一意のバンドパターンによって形成されているかを決定し、そのケースでは、サンプルはホモプラスミックである。しかしながら、解析が、２つの異なるミトコンドリアＤＮＡ母集団に対応する２つのバンディングパターンの存在を決定する場合には、ｍｔＤＮＡサンプルはヘテロプラスミックである。
【０１５０】
本明細書において使用される「一塩基多型」または「一塩基多型」または「ＳＮＰ」という用語は、一塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ）において生じる核酸のヌクレオチド配列におけるバリエーションのことを言い、あらゆる可能な配列が母集団の１％以上の割合で存在する。これらの多型は、ゲノムにおける一塩基が（たとえば、置換、付加、または欠失によって）変えられた場合に出現する。多型サイトに対する配列の各々のバージョンは、多型サイトの対立遺伝子と呼ばれる。ＳＮＰは、代々進化的に安定する傾向にあり、そのようなものとして、母集団における特異的な遺伝子異常を研究するために使用され得る。
【０１５１】
発明の多型バリアントは、ＮＣＢＩデータベースにおいて番号ＮＣ＿０１２９２０によって定義されたナンバリングに基づいた、位置１６５１９である。多型バリアントは、前記位置においてＣを含む。
【０１５２】
「ＳＮＰの配列決定」または「ＳＮＰを検出すること」という用語は、本明細書において同義で使用され、研究下の被験者における特定のＳＮＰの配列の決定のことを言う。ＳＮＰの配列を決定することは、当業者に知られているさまざまなプロセスによって行われ得る。
【０１５３】
発明のいくつかの特定の実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡを備えるサンプルは、固体組織のバイオプシーまたは生物流体から選択される。サンプルは、当業者に知られている従来の方法によって得られうる。
【０１５４】
より一層特定の実施形態において、生物流体は、末梢血または脳脊髄液から選択される。
より一層特定の実施形態において、前記固体組織は、脳組織である。
【０１５５】
本方法にしたがって前記ＳＮＰを決定することが所望される材料が固体組織または生物流体である場合、好ましくは、サンプルからの従来の核酸抽出が存在し、この核酸抽出は、このための任意の適切な技法を使用する。
【０１５６】
発明の好ましい実施形態において、発明の実現に適したＤＮＡフラクションは、トータルＤＮＡである。ＤＮＡ抽出は、発明の第１の方法において詳述されているように、当業者に知られている任意の方法を使用して実行され得る。
【０１５７】
所望される場合、本方法は、あらかじめミトコンドリアフラクションが分離されていて、後続してそのＤＮＡが分離された、サンプルにおいて実行され得る。ミトコンドリアフラクションの分離は、任意の知られている細胞フラクショネーション方法を使用して行われ得、本発明の第１の方法において詳述されている。
【０１５８】
核酸を分離し、（必要であれば）増幅した後、発明のＳＮＰ配列が、ＳＮＰまたは多型中に存在するヌクレオチドを決定することができる任意の方法または技法により検出される。たとえば、ＳＮＰは、シークエンシング、ミニシークエンシング、ハイブリダイゼーション、制限酵素断片解析、オリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、またはそれらの組み合わせを行うことにより検出され得る。そのようなものとして、核酸シークエンシング、ハイブリダイゼーション方法、およびアレイテクノロジー（たとえば、ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ａｃｌａｒａ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、等で利用可能なテクノロジー）に限定されるシステムおよび方法もまた、増幅された核酸断片のモビリティシフトに基づいた技法、たとえば、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、化学ミスマッチ切断（ＣＭＣ）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、波分析、等において使用され得る（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００４；１０８：１７３−８８）。当然のことながらこのリストは、単なる例示であり、決して限定ではない。この分野における熟練者は、そのような検出を達成するのに適した任意の方法を使用し得る。
【０１５９】
別の特定の実施形態において、前記ＳＮＰの配列を決定することは、ＰＣＲ−ＲＦＬＰによって行われる。
【０１６０】
特定の実施形態において、発明の第４の方法は、ＡＤの早いステージを診断するためのインビトロ法に対応する。本明細書において使用される「アルツハイマー病の早いステージ」という用語は、発明の第１の方法の文脈において定義されたブラークスケールによるアルツハイマー病のステージＩ〜ＩＩのことを言う。
発明の第５の方法
第５の特徴において、発明は、アルツハイマー病の予防的治療の施行のための被験者を選択するためのインビトロ法に対応し、この方法は、前記被験者からのミトコンドリアＤＮＡを含むサンプルにおいて、ＮＣＢＩデータベースにおいてアクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０を有する配列に係る多型位置１６５１９でのヌクレオチドを決定することを含み、ミトコンドリアＤＮＡ分子の少なくとも６０％における、前記多型位置でのＣヌクレオチドの検出または前記多型位置でのヌクレオチドＣの存在は、前記被験者がアルツハイマー病を予防することを目的とした治療を受ける候補であることを示す。
【０１６１】
「アルツハイマー」、「治療」、「サンプル」、「ミトコンドリアＤＮＡ」、および「多型」という用語、ならびに、サンプルを得て多型を検出するための方法は、発明の第１、第２、第３、および第４の方法の文脈において詳述されており、ここでも同一の意味で使用される。
【０１６２】
発明の第５の方法によると、被験者のｍｔＤＮＡが、アクセス番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９でヌクレオチドＣを有する場合、前記位置において前記ヌクレオチドを有するｍｔＤＮＡ分子のパーセンテージが、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、またはそれ以上である場合、被験者がアルツハイマー病を予防することを目的とした治療を施行される候補であると考えられる。特定の実施形態において、被験者のｍｔＤＮＡが、ｍｔＤＮＡ分子の６０％において、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６，５１９でヌクレオチドＣを提示する場合、前記被験者はアルツハイマー病の予防的治療を受けるのに適格であると考えられる。
【０１６３】
当業者は、ｍｔＤＮＡ分子の少なくとも６０％における多型の存在の同定が、アルツハイマー病の予防的治療を施行される被験者を選択するのに同様に有用であること、被験者のｍｔＤＮＡが、それがホモプラスミックを提示するケースにおけるごとくヘテロプラスミックを提示すること、を理解するだろう。そのように、そのｍｔＤＮＡがホモプラスミックである被験者のケースにおけるごとく分子全体が位置１６５１９でヌクレオチドＴまたはヌクレオチドＣを提示するケースでは、患者がアルツハイマー病のための予防的治療を受ける候補であることを示す多型を有するｍｔＤＮＡ分子のパーセンテージは、１００％または０％のいずれかである。そのように、そのｍｔＤＮＡがヘテロプラスミックである被験者のケースでは、位置１６５１９でＴヌクレオチドを提示するＭｔＤＮＡ分子の母集団が存在し、分子の第２の母集団は、位置１６５１９でＣヌクレオチドを提示するであろう。そのケースでは、位置１６５１９においてヌクレオチドＣを提示するｍｔＤＮＡの分子のパーセンテージが６０％未満またはそれより多い場合、患者がアルツハイマー病の予防的治療のための候補であると考えられるであろう。
【０１６４】
発明のいくつかの特定の実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡを備えるサンプルは、固体組織のバイオプシーまたは生物流体から選択され、サンプルは、当業者に知られている従来の方法によって得られうる。
【０１６５】
特定の実施形態では、本発明の文脈において、ミトコンドリアＤＮＡのサンプルは、ホモプラスミックであり、そのケースでは、被験者において存在するすべてのミトコンドリアが同一の遺伝物質を含むので、被験者のすべてのミトコンドリアは、それらのゲノムにおいて、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下の配列に係る多型位置１６５１９においてヌクレオチドＣを提示する。ミトコンドリアＤＮＡサンプルがホモプラスミックである実施形態において、発明の第５の方法は、前記ミトコンドリアＤＮＡサンプルにおいて、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９でのヌクレオチドＣの検出により、アルツハイマー病の予防的治療を施行される患者を選択することを可能にし、すなわち、患者からのホモプラスミックミトコンドリアＤＮＡのサンプルにおける、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９でのヌクレオチドＣの検出は、被験者がアルツハイマー病の予防的治療を受けるのに適格であることを示す。逆に、患者からのホモプラスミックミトコンドリアＤＮＡのサンプルにおける、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９におけるヌクレオチドＴの検出は、前記患者がアルツハイマー病のための予防的治療を受ける候補でないことを示す。
【０１６６】
発明の別の特定のおよび好ましい実施形態では、ミトコンドリアＤＮＡサンプルは、ヘテロプラスミックであり、すなわち、被験者のｍｔＤＮＡは、その遺伝物質が互いに同一でない２つのミトコンドリア母集団のものである。本発明によると、ヘテロプラスミーとは、前記被験者のミトコンドリアのうちのあるパーセンテージが、そのゲノムにおいて、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９においてオリゴヌクレオチドＣを提示し、前記被験者のミトコンドリアの残りのパーセンテージは、そのゲノムにおいて、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０の下で定義された配列に係る多型位置１６５１９においてオリゴヌクレオチドＴを提示する、ということを言う。
【０１６７】
サンプルがホモプラスミックかヘテロプラスミックかを決定するための、ならびに、サンプルのヘテロプラスミーの度合を決定するための方法は、発明の第４の方法の文脈において詳述されており、参照によりここに組み込まれる。
【０１６８】
より一層特定の実施形態において、生物流体は、末梢血または脳脊髄液から選択される。
より一層特定の実施形態において、前記固体組織は、脳組織である。
【０１６９】
本方法にしたがって前記ＳＮＰを決定することが所望される材料が固体組織または生物流体である場合、好ましくは、サンプルからの従来の核酸抽出が存在し、この核酸抽出は、このための任意の適切な技法を使用する。発明の好ましい実施形態において、発明の実現に適したＤＮＡフラクションは、トータルＤＮＡである。ＤＮＡの抽出は、発明の第１の方法において詳述されているように、当業者に知られている任意の適切な方法を使用して実行され得る。
【０１７０】
別の特定の実施形態において、前記ＳＮＰの配列を決定することは、ＰＣＲ−ＲＦＬＰによって行われる。
発明のポリヌクレオチド
別の特徴において、本発明は、核酸に対応し（以下、「発明の第１のポリヌクレオチド」）、この核酸は、ｍｔＤＮＡ領域における少なくとも９つの連続するポリヌクレオチドを備え、前記領域は、表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトから選択された少なくとも１つのメチル化サイトを備える。
【０１７１】
本明細書において使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、長さにおいて１４塩基以上のＤＮＡまたはＲＮＡ分子のことを言う。発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、長さにおいて、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００塩基、またはそれ以上のＤＮＡ分子である。
【０１７２】
特定の実施形態において、発明の第１のポリヌクレオチドは、表１から選択された少なくとも１つのＣｐＧサイトに対する、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを備える。
【０１７３】
別の特徴において、本発明は、核酸に関し（以下、「発明の第２のポリヌクレオチド」）、この核酸は、ミトコンドリアＤＮＡ領域における少なくとも９つの連続するポリヌクレオチドを備え、前記領域は、表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイトから選択された少なくとも１つのメチル化サイトを含む。
【０１７４】
特定の実施形態において、発明の第２のポリヌクレオチドは、表２から選択された前記少なくとも１つのＣｐＧサイトに対する、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを備える。
【０１７５】
別の特徴において、本発明は、核酸に関し（以下、「発明の第２のポリヌクレオチド」）、この核酸は、ミトコンドリアＤＮＡ領域における少なくとも９つの連続するポリヌクレオチドを備え、前記領域は、表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトから選択された少なくとも１つのメチル化サイトを備える。
【０１７６】
特定の実施形態において、発明の第３のポリヌクレオチドは、表３から選択された前記少なくとも１つのＣＨＧサイトに対する、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを備える。
【０１７７】
別の特徴において、本発明は、核酸に関し（以下、「発明の第４のポリヌクレオチド」）、この核酸は、ミトコンドリアＤＮＡ領域における少なくとも９つの連続するポリヌクレオチドを備え、前記領域は、表４において示されたＮＤ１遺伝子のＣＨＧサイトから選択された少なくとも１つのメチル化サイトを含む。
【０１７８】
特定の実施形態において、発明の第４のポリヌクレオチドは、表４から選択された前記少なくとも１つのＣＨＧサイトに対する、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを備える。
【０１７９】
別の特徴において、本発明は、核酸のことを言い（以下３５、以下、「発明の第５のポリヌクレオチド」）、この核酸は、ｍｔＤＮＡ領域における少なくとも９つの連続するポリヌクレオチドを備え、前記領域は、表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイトから選択された少なくとも１つのメチル化サイトを備える。
【０１８０】
特定の実施形態において、発明の第５のポリヌクレオチドは、表５から選択された前記少なくとも１つのＣＨＨサイトに対する、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを備える。
【０１８１】
別の特徴において、本発明は、核酸に対応し（以下、「発明の第６のポリヌクレオチド」）、この核酸は、ミトコンドリアＤＮＡ領域における少なくとも９つの連続するポリヌクレオチドを備え、前記領域は、表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトから選択された少なくとも１つのメチル化サイトを備え、前記ＣｐＧサイトにおけるシトシンの対応する位置は、ウラシルである。
【０１８２】
特定の実施形態において、発明の第６のポリヌクレオチドは、表１から選択された前記少なくとも１つのＣｐＧサイトに対する、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを備え、前記ＣｐＧサイトにおけるシトシンの対応する位置は、ウラシルである。
【０１８３】
別の態様において、本発明は、核酸のことを言い（以下、「発明の第７のポリヌクレオチド」）、この核酸は、ミトコンドリアＤＮＡ領域における少なくとも９つの連続するポリヌクレオチドを備え、前記領域は、表２において示されたＮＤ１遺伝子のＣｐＧサイトから選択された少なくとも１つのメチル化サイトを備え、前記ＣｐＧサイトにおけるシトシンの対応する位置は、ウラシルである。
【０１８４】
特定の実施形態において、発明の第７のポリヌクレオチドは、表２から選択された前記少なくとも１つのＣｐＧサイトに対する、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを備え、前記ＣｐＧサイトにおけるシトシンの対応する位置は、ウラシルである。
【０１８５】
別の特徴において、本発明は、核酸のことを言い（以下、「発明の第８のポリヌクレオチド」）、この核酸は、ミトコンドリアＤＮＡ領域における少なくとも９つの連続するポリヌクレオチドを備え、前記領域は、表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイト選択された少なくとも１つのメチル化サイトを備え、前記ＣＨＧサイトにおけるシトシンの対応する位置は、ウラシルである。
【０１８６】
特定の実施形態において、発明の第８のポリヌクレオチドは、表３から選択された前記少なくとも１つのＣＨＧサイトに対する、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを備え、前記ＣＨＧサイトにおけるシトシンの対応する位置は、ウラシルである。
【０１８７】
別の特徴において、本発明は、核酸に関し（以下、「発明の第９のポリヌクレオチド」）、この核酸は、ミトコンドリアＤＮＡ領域における少なくとも９つの連続するポリヌクレオチドを備え、前記領域は、表４において示されたＮＤ１遺伝子のＣＨＧサイトから選択された少なくとも１つのメチル化サイトを備え、前記ＣＨＧサイトにおけるシトシンの対応する位置は、ウラシルである。
【０１８８】
特定の実施形態において、発明の第９のポリヌクレオチドは、表４から選択された前記少なくとも１つのＣＨＧサイトに対する、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを備え、前記ＣＨＧサイトにおけるシトシンの対応する位置は、ウラシルである。
【０１８９】
別の特徴において、本発明は、核酸に関し（以下、「発明の第１０のポリヌクレオチド」）、この核酸は、ミトコンドリアＤＮＡ領域における少なくとも９つの連続するポリヌクレオチドを備え、前記領域は、表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイトから選択された少なくとも１つのメチル化サイトを備え、前記ＣＨＨサイトにおけるシトシンの対応する位置は、ウラシルである。
【０１９０】
特定の実施形態において、発明の第１０のポリヌクレオチドは、表５から選択された前記少なくとも１つのＣＨＨサイトに対する、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを備え、前記ＣＨＨサイトにおけるシトシンの対応する位置は、ウラシルである。
【０１９１】
別の特徴において、発明は、発明の前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、および第１０のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。
【０１９２】
本明細書において使用される、「特異的にハイブリダイズする」または「特異的な形式でハイブリダイズすることができる」という表現は、ＣｐＧ、ＣＨＧ、またはＣＨＨサイトの配列を特異的に認識するオリゴヌクレオチドのまたはポリヌクレオチドの能力のことを言う。本明細書において使用される場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的塩基間の特異的な対合により単純な二本鎖分子を結果として生じる高い度合の類似性を有する２つの核酸分子または一本鎖分子を組み合わせるプロセスである。一般に、ハイブリダイゼーションは、非常にストリンジェントな条件または適度にストリンジェントな条件下で行われる。
【０１９３】
当該技術において知られているように、２つの核酸分子間の「類似」は、分子のヌクレオチド配列を第２の分子のヌクレオチド配列と比較することにより決定される。本発明に係るバリアントは、表１から５において示されたサイトから選択された前記少なくとも１つのＣｐＧ、ＣＨＨ、およびＣＧＨサイトの配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％類似の、または同一の、ヌクレオチド配列を含む。２つの核酸分子間の同一性の度合は、当業者に広く知られているコンピュータアルゴリズムおよび方法を使用して決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムによって決定される（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，１９９０，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ.２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）。
【０１９４】
ハイブリダイゼーション反応の「厳格さ」は、当業者によって容易に決定され、一般的には、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存した経験的計算である。一般的に、より長いプローブは、適切なアニーリングのために、より高い温度を要求する一方で、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは一般的に、相補鎖がそれらの融解温度を下回る環境中に存在する際の変性ＤＮＡの再アニーリング能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の度合が高ければ高いほど、使用され得る相対温度は高い。結果として、より高い相対温度は、よりストリンジェントな反応条件を作り出す傾向にある一方で、より低い温度は、それほどでもなかろう、ということが推測される。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの追加の詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照。
【０１９５】
本明細書において使用される「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」という用語は典型的に、（１）低いイオン強度および高い洗浄温度、たとえば、５０℃のナトリウムで０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５クエン酸塩／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、を用いるか、（２）ハイブリダイゼーション中、４２℃で、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムとともに、ホルムアミド、たとえば、０．１％ウシ血清アルブミンによる５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドのような変性剤／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／ｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファを用いるか、または（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を用い、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミドにおける４２℃での洗浄の後に、５５℃でのＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣにおける高ストリンジェンシー洗浄が続く。
【０１９６】
「適度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ аｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９によって説明されているように同定され得、上述されたものよりもストリンジェントでない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（たとえば、温度、イオン強度、および％ＳＤＳ）の使用を含む。適度にストリンジェントな条件の例は、約３５、３７〜５０℃での１×ＳＳＣにおけるフィルターの洗浄が後に続く、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍｌの断片化された変性サケ精子ＤＮＡを備える溶液における３７℃でのオーバーナイトインキュベーションである。当業者は、プローブ長、等といったファクターを適応させる必要がある場合、温度、イオン強度、等をどのように調節するかを知っているであろう。
発明のキット
別の特徴において、本発明は、キットに関し（以下、発明の第１のキット）、このキットは、
（ｉ）表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイト、
（ｉｉ）表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイト、
（ｉｉｉ）表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイト、
（ｉｖ）表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイト、および／または
（ｖ）表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイト
によって形成されたグループから選択されたメチル化サイトを備えるミトコンドリアＤＮＡ配列とメチル化に依存した手法で特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを備える。
【０１９７】
「ＣｐＧサイト」、「ＣＨＧサイト」、「ＣＨＨサイト」、「Ｄ−ループ領域」、および「ＮＤ１遺伝子」という用語は、発明の第１の方法の文脈において詳細に説明されており、「特異的な形式でハイブリダイズすることができる」という用語は、発明のポリヌクレオチドの文脈において定義されている。これらの用語は、発明キットの文脈において同一の意味で使用される。
【０１９８】
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、
（ｉ）表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイト、
（ｉｉ）表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイト、
（ｉｉｉ）表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイト、
（ｉｖ）表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイト、および／または
（ｖ）表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイト
からなるグループから選択されたメチル化サイトを備えるミトコンドリアＤＮＡ配列とメチル化に依存して特異的にハイブリダイズすることができる発明キットの一部である。
【０１９９】
それらは、キットを形成するオリゴヌクレオチドの合計量の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％を構成する。さらなる実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、キットを形成するオリゴヌクレオチドの合計量の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である。
【０２００】
適切なキットは、チューブと、ガラス瓶と、シュリンクラップ包装およびブロー成形機とを含む、適切な容器および包装材料における、本発明に係る使用のためのさまざまな試薬を含む。加えて、発明キットは、キットにおいて見出されるさまざまな構成要素の、同時の、連続の、または別個の使用のためのインストラクションを含み得る。そのようなインストラクションは、印刷材料の形態、または、インストラクションが被験者によって読み出され得るようにそれらを記憶することができる電子媒体、たとえば、電子記憶媒体（磁気ディスク、テープ、等）、光媒体（ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ）、等の形態におけるものであり得る。加えて、またはあるいは、媒体は、そのようなインストラクションを提供するインターネットアドレスを含み得る。
【０２０１】
本発明に係る例示的なキットに含まれる適切な材料は、以下の１つ以上、すなわち、ＰＣＲを実行する必要なしにトータルＤＮＡまたはｍｔＤＮＡのいずれかのドメインの特定の配列を増幅することができる試薬、ＰＣＲ増幅または非ＰＣＲ（たとえば、制限エンドヌクレアーゼ、オリゴヌクレオチド信号を増幅してメチル化または非メチル化ＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイトＣＨＨ間の判別をよりロバストにする酵素または蛍光化学物質のグループを含むように変更されたものを含む、好ましくはメチル化または非メチル化ＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイトとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）によって増幅された配列ドメインにおける異なる可能な対立遺伝子を判別するために必要とされる試薬、または、さまざまな増幅産物領域を物理的に切り離すために必要とされる試薬（たとえば、電気泳動における使用のためのアガロースまたはポリアクリルアミドおよびバッファ、ＨＰＬＣカラム、ＳＳＣＰゲル、ホルムアミドゲル、またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのためのサポートマトリックス）の１つ以上を備える。
【０２０２】
本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、何塩基かの長さを有するＤＮＡ分子または短いＲＮＡのことを言う。発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、または５０塩基の長さのＤＮＡ分子である。
【０２０３】
発明のキットにおいて使用される場合、メチル化特異的な手法で、表１において示されたＣｐＧサイトから選択されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトの少なくとも１つの配列とハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイトの少なくとも１つの配列とハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトの少なくとも１つの配列とハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイトの少なくとも１つの配列とハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、および／または、表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイトの少なくとも１つの配列とハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、前記ＣｐＧ、ＣＨＧ、および／またはＣＨＨサイト（単数または複数）を含む領域を増幅するためのプライマーとして使用される。あるいは、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、メチル化または非メチル化されたそのようなＣｐＧ、ＣＨＧ、またはＣＨＨサイトを検出するためのプローブとしても使用され得る。
【０２０４】
発明の第１のキットの好ましい実施形態は、表１において示されたＤ−ループ領域におけるすべてのＣｐＧサイトと、表２において示されたＮＤ１遺伝子のすべてのＣｐＧサイトと、表３において示されたＤ−ループ領域のＣＨＧサイトのすべてと、表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイトのすべてと、および／または、表５において示されたＤ−ループ領域におけるすべてのＣＨＨサイトと、特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを備える。
【０２０５】
所望される場合、発明の第１のキットは、表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイトがメチル化されている場合に前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つの配列を備えるバイサルファイト処理されたオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることができる第１のオリゴヌクレオチドと、Ｄ−ループ領域におけるＣｐＧサイトがメチル化されていない場合に前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つの配列を備える同一のバイサルファイト処理されたオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとを備え得、および／または、キットは、表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイトがメチル化されている場合に前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つの配列を備えるバイサルファイト処理されたオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることができる第１のオリゴヌクレオチドと、Ｄ−ループ領域のＣｐＧサイトがメチル化されていない場合に前記ＣｐＧサイトの少なくとも１つの配列を備える同一のバイサルファイト処理されたオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとを備え得、および／または、キットは、表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイトがメチル化されている場合に前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つの配列を備えるバイサルファイト処理されたオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることができる第１のオリゴヌクレオチドと、Ｄ−ループ領域のＣＨＧサイトがメチル化されていない場合に前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つの配列を備える同一のバイサルファイト処理されたオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとを備え得、および／または、キットは、表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイトがメチル化されている場合に前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つの配列を備えるバイサルファイト処理されたオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることができる第１のオリゴヌクレオチドと、Ｄ−ループ領域におけるＣＨＧサイトがメチル化されていない場合に前記ＣＨＧサイトの少なくとも１つの配列を含む同一のバイサルファイト処理されたオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとを備え得、および／または、キットは、表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイトがメチル化されている場合に前記ＣＨＨサイトの少なくとも１つの配列を備えるバイサルファイト処理されたオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることができる第１のオリゴヌクレオチドと、Ｄ−ループ領域におけるＣＨＨサイトがメチル化されていない場合に前記ＣＨＨサイトの少なくとも１つの配列を備える同一のバイサルファイト処理されたオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとを備え得る。
【０２０６】
非メチル化ＣｐＧサイトのハイブリダイゼーションのために、非メチル化ＤＮＡとハイブリダイズする特異的なプライマーは、好ましくは、ＣＧ対においてＴを有し、それをメチル化ＤＮＡにおいて保持されるＣと区別する。Ｃはセンスプライマーに欠如しているであろうし、Ｇはアンチセンスプライマーに欠如しているであろう（シトシンは、ウラシルへと変換され、それは、増幅産物においてチミジンとして増幅される）から、プライマーが配列において、相対的に少数のＣまたはＧを含むことは好ましい。したがって、メチル化ＣｐＧサイトとのハイブリダイゼーションのために、メチル化ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするプライマーは、好ましくは、３’のＣＧ対でＣを有する。
【０２０７】
別の特徴において、発明は、キットに関し（以下、「発明の第２のキット」）、このキットは、
ｉ．表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイト、
ｉｉ．表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイト、
ｉｉｉ．表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイト、
ｉｖ．表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイト、および／または
ｖ．表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイト
からなるグループから選択されたミトコンドリアＤＮＡのメチル化サイトに対し５’から３’の位置においてゾーンと特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを備え、前記位置におけるメチル化されたシトシンは、ウラシル、または、そのハイブリダイゼーション特性においてシトシンとは区別可能な別の塩基へと変換されている。
【０２０８】
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、発明のキットの一部を形成し、
ｉ．表１において示されたＤ−ループ領域におけるＣｐＧサイト、
ｉｉ．表２において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣｐＧサイト、
ｉｉｉ．表３において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＧサイト、
ｉｖ．表４において示されたＮＤ１遺伝子におけるＣＨＧサイト、および／または
ｖ．表５において示されたＤ−ループ領域におけるＣＨＨサイト
によって形成されたグループから選択されたミトコンドリアＤＮＡにおけるメチル化サイトに対し領域または位置５’または位置３’と特異的にハイブリダイズすることができる。
【０２０９】
それらは、キットを形成するオリゴヌクレオチドの合計量の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％を構成する。さらなる実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、キットを構成するオリゴヌクレオチドの合計量の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成する。
【０２１０】
特定の実施形態において、発明の第２のキットはさらに、非メチル化シトシンを、ウラシル、または、ハイブリダイゼーション特性の観点でシトシンとは差別的に検出可能な別の塩基へと変換するための１つ以上の試薬を備える。
【０２１１】
好ましい実施形態において、非メチル化シトシンを、ウラシル、または、ハイブリダイゼーション特性の観点でシトシンとは検出可能に異なる別の塩基へと変換するための１つ以上の試薬は、バイサルファイト、好ましくは重亜硫酸ナトリウムである。非メチル化シトシンを、ウラシル、または、ハイブリダイゼーション特性の観点でシトシンとは差別的に検出可能な別の塩基へと変換することができる試薬は、メタ重亜硫酸塩、好ましくはメタ重亜硫酸ナトリウムである。
【０２１２】
「変換試薬」という用語およびその詳細は、発明の診断方法の文脈において詳細に説明され、発明に係るキットの文脈において同一の意味で使用される。
【０２１３】
特定の実施形態において、発明の第２のキットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５において示された配列から選択された配列を備える少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを備える。
【０２１４】
別の特徴において、発明は、被験者におけるミトコンドリアＤＮＡのパターンを決定するための、または、アルツハイマー病およびパーキンソン病から選択された被験者における神経変性疾患の診断を決定するための、発明の第１および／または第２のキットの使用のことを言う。
【０２１５】
発明は、単に例示的なものとして解釈されるべきであり、発明の範囲の限定ではない、以下の実施例によって説明される。
【実施例】
【０２１６】
［材料および方法］
［研究デザインおよび含まれる被験者］
研究は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）に関連する病理と、コントロールケースとを含む、４４サンプルについて行われた。サンプルは、２レーンに分割されたプレートにおいて処理された。レーン１では、Ｄ−ループ、ＮＤ１のアンプリコンおよびサンプルが、ＡＤの病理に関連する嗅内皮質のケースおよび対応するコントロールにおいて解析された（表７）。レーン２では、Ｄ−ループのアンプリコンが、ＰＤにおける黒質のサンプルおよびその対応するコントロールについて解析された（表７）。各々の患者は、ＭＩＤ（マルチプレックス識別子）とともに使用されたプライマーで識別された（表７および表８）。ＣｐＧサイトおよびＣｐＧではないサイト（ＣＨＧおよびＣＨＨ、ここで、Ｈ＝Ａ、Ｔ、またはＣ）におけるメチル化が、Ｒｏｃｈｅのパイロシークエンサ４５４ ＧＳ ＦＬＸ Ｔｉｔａｎｉｕｍを使用して解析され、同パイロシークエンサは、レーン１において５６９，６８４個の配列を生み出し、その長さは、４０〜１０９８塩基対（ｂｐ）で変動し、約４１７ｂｐの平均長を有した。レーン２では、得られた配列の数は５１３，５７９個であり、その長さは４０〜９３３ｂｐ（４６６ｂｐの平均長）の範囲に及んだ。各々のＭＩＤ、アンプリコン、およびレーンについて得られた配列の、それらのそれぞれの参照配列に対するアラインメントが注意され、これらの間の同一性のパーセンテージは、ほぼ１００％だった。各々の遺伝子座およびＭＩＤについてのバイサルファイト変換率の平均値および中央値が解析された。
【０２１７】
非メチル化配列の数は、各々のサイトにおいて同定されたメチル化配列の数を超え、いくつかのメチル化サイトは存在しなかった。アラインメント後のそれらの配列は、少なくとも１つの存在しないメチル化パターンのサイトを有することが見出され、量子化のときに任意のバイアスを避けるために解析から取り除かれた。これは、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴにおいて解析された際にそのアンプリコンがミトコンドリアＤＮＡとほぼ１００％の同一性を提示した推定ミトコンドリア偽遺伝子の近似解析を回避する。解析されたほとんどのＣｐＧ、ＣＨＧ、およびＣＨＨサイトは、メチル化されていなかった。しかしながら、異なるメチル化のサイトが同定されることができた。
【０２１８】
【表６】

【０２１９】
【表７】


【０２２０】
【表８】

［ヒトの脳サンプル］
組織サンプルは、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｉｓｓｕｅ ＢａｎｋのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ−Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｄｅ ＢａｒｃｅｌｏｎａおよびＢａｎｋ ｏｆ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＮｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙのＨＵＢ−ＩＣＯ−ＩＤＩＢＥＬＬによって提供された。サンプルの寄付および調達は、両機関の倫理委員会によって統制された。各々の脳の半分は、形態学的および組織学的研究用にホルマリン４％バッファ溶液において維持されたが、もう半分は、生化学的研究用に利用可能であるよう、冠状薄片において処理されて−８０℃で凍結された。すべてのコントロールおよび病理的ケースにおける神経病理学的検査が、脳、小脳、および脳幹の３０個の画一化された薄片において行われ、それらは、ヘマトキシリンおよびエオシン、およびクリューバー・バレラによって染色されるか、または、グリア線維酸性タンパク質、ミクログリアマーカー、ベーターアミロイド、リン酸化タウ（ＡＴ８抗体）、α−シヌクレイン、β−クリスタリン、ユビキチン、およびＴＤＰ−４３のために免疫組織化学用に処理された。ＡＤおよびＰＤに関連する病理によるケースは、現在の神経病理学的基準（Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋ １９９１，１９９９；Ｂｒａａｋ ｅｔ ａｌ，２００３，２００６）にしたがって分類された。（血管病変を含む）混在した病理によるケースは、この研究から除かれた。コントロールとして使用された脳は、神経学的所見なし、神経学的研究における損傷なしの個体に属した。診療記録が各々のケースについて再調査され、ＡＤ（ステージＩ〜ＩＶ）に関連する病理によるケースは、近親者との通話または面接を通じ、彼らが任意の神経または認知の障害の証拠を有したかどうかを尋ね、再評価された。これらの基準を満たすケースのみが、この作業において考慮された。解析されたすべてのケースが表７にまとめられている。
【０２２１】
嗅内皮質サンプルの平均死後間隔は、コントロールにおいて４．９８±１．５７時間、ステージＩ〜ＩＩにおいて７．５１±５．１３時間、ステージＩＩＩ〜ＩＶにおいて５．７０±２．８５時間であり、黒質のサンプルについては、間隔は、コントロールにおいて５．５９±２．４６時間、ＰＤのケースにおいて９．２３±７．０７時間だった。
［マウスの脳サンプル］
トランスジェニックマウスＡＰＰ／ＰＳ１および野生型が、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＵＳＡ）から得られた。トランスジェニックモデルは、マウス／ヒトキメラＡＰＰ（Ｍｏ／ＨｕＡＰＰ６９５ｓｗｅ：スウェーデン変異ＡＰＰ）分子とプレセニリン１のヒトバリアント（ＰＳ１−ＤＥ９）とを発現させ、両発現は、神経系産物のニューロンにおけるものである。動物は、１２時間の明暗サイクルと、食料および水への無制限のアクセスとによる、標準的な条件で収容された。設備への収容は、ローカルな倫理委員会によって承認された倫理ガイドライン（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ８６／６０９／ＥＥＣ）にしたがって行われた。
［トータルＤＮＡ抽出］
トータルＤＮＡが、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）を製造者のインストラクションにしたがって使用して、嗅内皮質および黒質のヒトのサンプルから分離された（表７）。マウスのトータルＤＮＡサンプルが、同一の手順を使用して前頭皮質から得られた。
［バイサルファイト処理］
３００ナノグラムのＤＮＡが、ＥＺ ＤＮＡ ｋｉｔ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｃｏｇｅｎ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）を供給者のインストラクションにしたがって使用して、バイサルファイト処理された。バイサルファイト処理されたＤＮＡは、１０ｎｇ／ｕｌの最終濃度に到達するまで３０μｌで再懸濁させられた。すべてのサンプルは、異なる市販ロット間でのバイサルフアイト変換率における差を避けるために、同一バッチの試薬を使用して、並行してバイサルファイトにより処理された。
［アンプリコンのためのプライマーＦＬＸの設計−ＤループおよびＮＤ１］
ＦＬＸ実験用のプライマーは、ＦＬＸシークエンサのための技法のインストラクション、Ｒｏｃｈｅの「Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ＧＳ ＦＬＸ Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｌｉｂ−Ａ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」にしたがって設計された。指向性プライマー、第５ロットのＧＳ ＦＬＸチタニウムプライマーＡまたはプライマーＢ（基本的な配列（キー）の４塩基を含む）と、末端のオリゴヌクレオチドと、３での鋳型のための特異的配列とを含む、アンプリコンのためのプライマーを融解し、第１の終了。さらに、ＭＩＤ配列が、グルーピング／マルチプレクシングおよびシークエンシングステップ後の後続の自動サンプル識別ソフトウェアのためにプライマーＡ（またはプライマーＢ）と特異的配列との間に付加された（マルチプレックス識別子）。使用されたプライマーは、以下の構成要素、すなわち、フォワードプライマー（プライマーＡ−キー−ＭＩＤ−特異的配列の鋳型）の、５’−ＣＧＴＡＴＣＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）−ＴＣＡＧ−ＭＩＤ−テンプレート特異的配列−３’と、リバースプライマー（プライマーＢ−キー−ＭＩＤ−テンプレート特異的配列）の、５’−ＣＴＡＴＧＣＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）−ＴＣＡＧ−ＭＩＤ−テンプレート特異的配列−３’とを含んだ。アンプリコンの各々のためのテンプレート特異的配列は、Ｄループのダイレクトが５’−ＴＡＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）であり、Ｄループのリバースが５’−ＡＣＡＡＡＣＡＴＴＣＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＡＴＣＣＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）であり、ＮＤ１のダイレクトが５’−ＡＴＧＧＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＧＴＡＴＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）であり、ＮＤ１のリバースが５’−ＴＡＡＴＴＴＡＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＴＣＡＣＣＣＴＡＡＴＣＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）である。この研究において使用されたプライマーは、ＣｐＧサイトを避けるように設計された。各々の患者に特異的なＭＩＤ配列が表８に示されている。増幅された領域（Ｄ−ループ：１６３８６〜２５６、ＮＤ１：３３１３〜３６８６）は、ヒトｍｔＤＮＡのヌクレオチド位置地図に基づいている（ｗｗｗ．ｍｉｔｏｍａｐ．ｏｒｇ）
［アンプリコンライブラリの調製］
Ｄ−ループおよびＮＤ１のためのアンプリコンのＰＣＲが、Ｒｏｃｈｅのマニュアル、Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ Ｍａｎｕａｌ（ＧＳ ＦＬＸ Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ）にしたがって行われた。２０ナノグラムのバイサルファイト処理されたトータルＤＮＡのためのＰＣＲが使用された。バイサルファイト処理されたＤＮＡの増幅は、反応量２５ｕｌにおいて実行される。各々のＰＣＲ反応は、１×ＦａｓｔＳｔａｒｔ １０×Ｂｕｆｆｅｒ ＃２、０．０５Ｕ／ｕｌポリメラーゼのＨｉＦｉ ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、２００ｎＭの各々のｄＮＴＰ、および２００ｎＭの各々の特異的なフォワードおよびリバースプライマーからなった。プライマーは、ＨＰＬＣ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｑｕａｌｉｔｙ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）によって合成された。増幅は、サーモサイクラーＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｅｒｉｔｙ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）において行われ、以下の条件、すなわち、３分間９４℃の後、１５秒間９４℃を３６サイクル、４５秒間（ＮＤ１は６１℃およびＤ−ループは６２℃の）アニーリング温度、および１分間７２℃の後に、８分間７２℃の最終伸長ステップが続き、４℃の最終維持温度、を使用した。２マイクロリットルの各々のＰＣＲ産物が、１．５％ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓａｆｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）によって染色されたアガロースゲルでチェックされた。
［ＰＣＲの精製］
ＰＣＲ産物の精製が、インストラクションマニュアル、ＲｏｃｈｅのＡｍｐｌｉｃｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ Ｍａｎｕａｌ（ＧＳ ＦＬＸ Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ）にしたがって、ｋｉｔ Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）を使用して行われた。
［アンプリコンおよびシークエンシングライブラリＦＬＸの定量化］
アンプリコンライブラリおよびＦＬＸシークエンシングプロトコルの残部の定量化および品質制御が、Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖａｌｌ ｄ’Ｈｅｂｒｏｎ（ＶＨＩＲ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）のチームによって行われた。
［差別的にメチル化されたサイトの選択］
ＣｐＧ、ＣＨＧ、およびＣＨＨサイトおよびバイサルファイト変換率のアラインメントおよび同定が、ＨＴ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＢＩＱ（Ｌｕｔｓｉｋ ｅｔ ａｌ，２０１１）のソフトウェアを使用して行われた。生データおよびすべての統計解析の品質制御。
【０２２２】
それらは、統計言語Ｒおよびバイオコンダクタソフトウェア、ｈｔｔｐ：／／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇを使用して行った。
【０２２３】
差別的にメチル化されたサイトの選択は、フィッシャーの正確確率検定の計算、統計的検定、０．０５を下回るベンジャミンとホックベルグ法（１９９５）を使用したｐ値セットを有する差別的にメチル化されたそれらのサイトを考慮することに基づいた。ヒートマップグラフにおいて表されたｂ値は、サイトあたりのメチル化および非メチル化配列の全体の合計に対するメチル化配列の比であり（Ｄｕ ｅｔ ａｌ，２０１０，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，３０；．１１：５８７）、すなわち、βｉ，ｊ＝Ｍ／（Ｍ ＯＲ）であり、ここで、Ｍは、サイト（ｉ）およびＭＩＤ（ｊ）でのメチル化配列の数であり、Ｕは、サイト（ｉ）およびＭＩＤ（ｊ）での非メチル化配列の数である。
［実施例１：ＤＮＡメチル化は、ＡＤの早いステージに関連する病理によるケースでは、Ｄ−ループ領域において増加し、ＮＤ１遺伝子において減少する］
ＣｐＧおよびＣｐＧでないサイト（ＣＨＧおよびＣＨＨ）におけるメチル化の増加が、ブラークのステージＩ／ＩＩおよびＩＩＩ／ＩＶに関連するＡＤの病理によるケースにおいて、Ｄ−ループ領域において観察された（図１）。
【０２２４】
メチル化の度合は、ｌｏｇ２グラフ（ＯＲ）（図２）において示されているように、コントロールサンプルに対しＡＤに関連する病理のケースにおいて、より高く、ステージＩＩＩ／ＩＶに対しステージＩ／ＩＩで、より高い。しかしながら、コントロールとステージＩＩＩ／ＩＶのＡＤに関連する病理によるケースとの間のＣＨＨサイトのメチル化における差は見出されなかった。
【０２２５】
ＮＤ１解析は、コントロールサンプルと比較して、関連するＡＤの病理のステージＩ／ＩＩおよびＩＩＩ／ＩＶによるケースにおける、より少なくメチル化されたいくつかのＣｐＧおよびＣＨＧサイトの存在を明らかにした（ｌｏｇ２［０］＞０、図３）。差はＣＨＨサイトについて見出されなかった。
［実施例２：ＤＮＡメチル化は、ＰＤケースの黒質では、Ｄ−ループ領域において減少する］
ＡＤにおいて嗅内皮質において観察されたものとは対照的に、Ｄ−ループ領域は、コントロールサンプルに対しＰＤケースの黒質におけるほとんどすべてのＣｐＧおよびＣｐＧではないサイトにおける、メチル化の喪失を示した（図３）。しかしながら、ＡＤによるように、ＤＮＡメチル化のパーセンテージは、全ミトコンドリアＤＮＡの少数部分を表す。
［実施例３：ＤＮＡメチル化は、ＡＤのマウスモデルにおいて、Ｄ−ループ領域において増加する］
この研究では、年齢６か月のマウスＡＰＰ／ＰＳ１（ＡＤのマウスモデル）（ｎ＝４）および同年齢のコントロールマウス（ｎ＝４）が使用された。図４Ａにおいて見られ得るように、ＣｐＧサイトは、コントロールサンプルに対しマウスモデルの病理から得られたサンプルにおいて、ハイパーメチル化を示した。これらの結果はまた、ＣＨＧサイトにおいても見られた（図４Ｂを参照）。
【０２２６】
ＡＤの発達としてのメチル化パターンを決定するために、彼らは、３、６、および１２か月のマウスＡＰＰ／ＰＳ１を用いた。３か月では、ＡＰＰ／ＡＰＳ１マウスは、神経突起斑の蓄積の低い度合を有し、それは６か月のＡＰＰ／ＡＰＳ１マウスでは増加する。月齢６か月のＡＤモデルマウスは、認知および記憶の失敗を示す。最後に、１２か月のＡＰＰ／ＡＰＳ１動物は、ＡＤの発達したステージにおいてヒトにおいて観察されるものと同様の症状を示す。
【０２２７】
Ｄ−ループ領域におけるメチル化の度合の解析は、ヒトの脳組織のサンプルにおいて観察されたパターンを立証した。図５において示されているように、ＣｐＧ、ＣＨＧ、およびＣＨＨサイトのハイポメチル化の傾向が、ＡＤの早いステージにおけるモデルマウスの前記ＣｐＧ、ＣＨＧ、およびＣＨＨサイトに対しＡＤの発達したステージにおけるモデルマウスにおいて観察された（図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃ）。
［実施例４：ミトコンドリアＤＮＡにおける多型位置１６５１９の存在は、アルツハイマー病の発病に関連づけられる］
表９において示された結果は、多型Ｔ１６５１９Ｃの存在がアルツハイマー病に関連づけられることを示す。前記結果は、従来のシークエンシングおよびカイ２乗検定を使用することにより得られた。
【０２２８】
【表９】

ヘテロプラスミーの存在がいくつかのケースにおいて観察され、サンプルの遺伝子型判定がＰＣＲ−ＲＦＬＰを使用することにより再度行われた。Ｃの対立遺伝子の存在は、制限酵素ＨａｅＩＩＩのための制限サイトを作製する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０において示された配列の増幅が、オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２を使用して実行された。
【０２２９】
遺伝子型に依存する以下のバンドパターンが得られた。
遺伝子型Ｔ：１８３ｂｐ、３１８ｂｐ
遺伝子型Ｃ：６１ｂｐ、１８３ｂｐ、２５７
ヘテロプラスミア：６１ｂｐ、１８３ｂｐ、２５７ｂｐ、３１９ｂｐ
【配列表】




















 
訂正の要旨 審決（決定）の【理由】欄参照。
審理終結日 2021-12-22 
結審通知日 2021-12-27 
審決日 2022-01-11 
出願番号 P2016-560431
審決分類 P 1 41・ 852- Y (C12N)
最終処分 01   成立
特許庁審判長 上條 肇
特許庁審判官 田村 聖子
伊藤 良子
登録日 2020-04-06 
登録番号 6687532
発明の名称 神経変性疾患のミトコンドリアマーカー  
代理人 特許業務法人にじいろ特許事務所  
代理人 特許業務法人にじいろ特許事務所  
代理人 特許業務法人にじいろ特許事務所  

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