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審決分類 審判 査定不服 2項進歩性 特許、登録しない。 C12P
管理番号 1387707
総通号数
発行国 JP 
公報種別 特許審決公報 
発行日 2022-09-30 
種別 拒絶査定不服の審決 
審判請求日 2020-03-23 
確定日 2022-08-16 
事件の表示 特願2018− 88777「DNAミニサークルおよびその使用」拒絶査定不服審判事件〔平成30年 9月13日出願公開、特開2018−139603〕について、次のとおり審決する。 
結論 本件審判の請求は、成り立たない。 
理由 第1 手続の経緯
本願は、平成21年8月27日(パリ条約による優先権主張 2008年9月2日 米国)を国際出願日とする特願2011−524379号の一部を新たな特許出願として平成26年11月25日に出願された特願2014−238069号の一部をさらに新たな特許出願として平成30年5月2日に出願されたものであって、その手続の経緯は以下のとおりである。
平成31年 2月26日付け 拒絶理由通知書
令和 1年 6月 4日 意見書、手続補正書の提出
令和 1年11月19日付け 拒絶査定
令和 2年 3月23日 審判請求書、手続補正書の提出
令和 2年 4月10日 手続補正書(審判請求書の請求の理由の補正)
令和 3年 5月27日付け 拒絶理由通知書
令和 3年10月20日 意見書、手続補正書の提出

第2 本願発明
本願の請求項1に係る発明は、令和3年10月20日付け手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項1に記載された事項により特定される、次のとおりのものである。
「【請求項1】
環状核酸をin vitroで生成する方法であって、該方法は:
部位特異的組換え部位を含む1種類の環状核酸鋳型を提供する工程;
環状核酸鋳型をローリングサークル増幅により増幅してコンカテマーを形成する工程、ここで、コンカテマーは、複数の組換え部位を含む、環状核酸鋳型配列のタンデムリピートユニットを含む;および
コンカテマーを、部位特異的組換えを媒介可能なタンパク質とインキュベーションして、環状核酸を生成する工程、
を含み、部位特異的組換えを媒介可能なタンパク質は、Creリコンビナーゼまたは酵母Flpリコンビナーゼから選択される、前記方法。」(以下、「本願発明」という。)

第3 拒絶の理由
令和3年5月27日付けで当審が通知した拒絶理由のうちの理由2(2)は、次のとおりのものである。
本願発明は、本願の出願前に日本国内又は外国において頒布された又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった以下の引用文献2に記載された発明及び周知技術に基づいて、その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法29条2項の規定により特許を受けることができない。

引用文献2:特表2008−522628号公報
引用文献3:Methods、 vol.28、 pp.374-383 (2002)(周知例)
引用文献4:Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、 vol.80、 pp.7284-7288 (1983)(周知例)
引用文献5:Cell、 vol.32、 pp.1301-1311 (1983)(周知例)

第4 当審の判断
1 引用文献2の記載事項
当審が通知した拒絶理由で引用された、本願優先日前に頒布された刊行物である引用文献2には、次の事項が記載されている。なお、下線は当審にて付したものである。
(摘記1) 「【特許請求の範囲】
【請求項1】
(a)鋳型−プライマーの複合体を形成させるため、反応液中の環状鋳型を少なくとも鋳型の一方の鎖に相補的な一つあるいはそれ以上のプライマーと結合させる工程と、
(b)前記環状鋳型のタンデムユニットを含むコンカテマーを合成するため、前記鋳型−プライマーの複合体を少なくとも一つのフィデリティの高い核酸ポリメラーゼと培養する工程と、
(c)前記コンカテマーを、目的とする配列を持つ送達ユニットを少なくとも一つ含む小さいフラグメントに切断する工程と、
を含む高品質核酸をセルフリー系で生産するための方法。
【請求項2】
(d)前記小さいフラグメントの末端を挿入あるいは除去する工程、小さい環状フラグメントを得るために前記小さいフラグメントの端部をライゲーションする工程、及び前記小さい環状フラグメントをスーパーコイル化する工程のうち、一つあるいはそれ以上の工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。」
(摘記2) 「【発明が解決しようとする課題】
【0024】
現在まで、RCA系は核酸のセルフリー合成を遺伝治療用、DNAワクチンあるいはその他の治療への応用に適合させていなかった。」
(摘記3) 「【課題を解決するための手段】
【0025】
本発明の一つの側面はインビトロのRCA系を最適化し、合理化された発現カセット、高度に特異的あるいは無作為のプライマー、高いフィデリティを持つポリメラーゼ、及び最小限の緩衝系を用い核酸大量調整(例えば>1mg)を行うセルフリー系を構築することに関する。この系では核酸の大量合成を、小さい容量で、短期間に最小限でかつ費用のかからない精製方法で行うことが可能である。このように、この系は、治療に利用できる高品質な核酸を、あらゆる基礎解析あるいは研究目的のため、さらに重要なことには治療上の使用のために合成可能である。」
(摘記4) 「【0031】
増幅に続き、核酸産物は意図する使用を容易にするように更なる処理を加えることができる。・・・細胞へのトランスフェクションは様々な形態において成されるが、高効率の取り込みは一般的に環状あるいはスーパーコイル化された核酸によって得られる。一つの実施態様は、増幅に続くDNAリガーゼを用いたライゲーション工程を含み、環状核酸(CNAs)を形成する。別の実施形態では、リコンビナーゼあるいは同様な酵素を用いて送達ユニットを円形にして環状核酸とする。」
(摘記5) 「【発明を実施するための最良の形態】
【0034】
本発明の実施態様は大量の高品質核酸を生産するための方法及び装置に関する。本発明の方法は治療上有用な、夾雑物が最小限である核酸産物を生産するため、ローリングサークル増幅法(RCA)に基づくセルフリー系を用いる(図2)。」
(摘記6) 「【実施例2】
【0090】
実施例2−ルシフェラーゼ(Luc−DU)の合成及びセルフリー増幅
pGL3ベクター(Promega Corp. Madison、 WI、 USA)をSal I及びXho Iで切断した。SV40プロモーター、ルシフェラーゼORF及びSV40小T抗原終結配列を含む約2.17kbの断片(Luc−DU)を単離し、精製し、T4 DNAリガーゼ(Invitrogen、 Carlsbad、 CA、 USA)を用いて製造業者の推奨に従って再環状化した。
【0091】
a)セルフリー増幅 ヘキサマー5’−ApApTpTpsGpsC−3’及び5’−ApGpCpApsApsT−3’を各々400pmolと反応液25μlあたり10ngの環状Luc−DUを含む反応液を95℃まで3分、40mMのトリス塩酸pH8;10mMの塩化マグネシウム中で加熱し、室温まで冷却した。Phi29 DNAポリメラーゼ(10U、New England Biolabs、 Beverly、 MA、 USA);1mMのdNTP(25/25/25/25);5%のグリセロール;0.7Uの酵母由来無機ピロホスファターゼ(Sigma、 St.Louis、 MO、 USA)及び100μg/mlのBSAを添加した。増幅反応は25μl反応液において30℃で50mMのトリス塩酸pH7.5;10mMの塩化マグネシウム;10mMの硫酸アンモニウム、4mMのDTT中で16時間行った。増幅に続いて、Phi29 DNAポリメラーゼを熱失活(65℃で10分)し、増幅されたLuc−DUコンカテマーをエタノール/塩沈殿して酵素製造業者の推奨に従いエンドヌクレアーゼ(BamH I)により切断した。エンドヌクレアーゼを熱失活(65℃で20分)した後、直鎖Luc−DUの環状化をDNAの1μgあたり0.1ユニット/μlのT4 DNAリガーゼ(Invitrogen Carlsbad、 CA、 USA)を含むライゲーション緩衝液(50mMのトリス塩酸pH7.6;5mMの塩化マグネシウム;1mMのATP;1mMのDTT;5%のPEG−8000)中にて14℃で12から16時間行った。環状化Luc−DUをエタノール/塩沈殿して10mMのトリス塩酸pH8.0に再懸濁した。」
(摘記7) 「【図2】



2 判断
(1)引用発明の認定
引用文献2の特許請求の範囲の請求項1を引用する請求項2及び図2には、工程(a)〜(d)を含む「高品質核酸をセルフリー系で生産するための方法」が記載されているところ(上記(摘記1、5、7))、この「高品質核酸」は遺伝子治療用やDNAワクチン用のものであって高い純度が求められており(上記(摘記2、3))、図2でも実施例でも1種類の鋳型が用いられていること(上記(摘記6、7))に照らすと、上記「方法」で用いられる「環状鋳型」は1種類のものであるし、上記「方法」で生産される「高品質核酸」は「環状鋳型」と同一のものと認められる。
したがって、引用文献2には次のとおりの発明が記載されているということができる。
「(a)鋳型−プライマーの複合体を形成させるため、反応液中の1種類の環状鋳型を少なくとも鋳型の一方の鎖に相補的な一つあるいはそれ以上のプライマーと結合させる工程と、
(b)前記環状鋳型のタンデムユニットを含むコンカテマーを合成するため、前記鋳型−プライマーの複合体を少なくとも一つの核酸ポリメラーゼと培養する工程と、
(c)前記コンカテマーを、目的とする配列を持つ送達ユニットを一つ含む小さいフラグメントに切断する工程と、
(d)小さい環状フラグメントを得るために前記小さいフラグメントの端部をライゲーションする工程
を含む、環状鋳型と同一の高品質核酸をセルフリー系で生産するための方法。」(以下、「引用発明」という。)

(2)対比
引用発明と本願発明とを対比すると、引用発明の「環状鋳型」、「環状鋳型と同一の高品質核酸」、及び「セルフリー系」は、本願発明の「環状核酸鋳型」、「環状核酸」、及び「in vitro」にそれぞれ相当し、引用発明の工程(a)及び(b)で行われる、「環状鋳型」を「プライマー」と結合させて「核酸ポリメラーゼ」により「環状鋳型のタンデムユニットを含むコンカテマーを合成する」ことは、本願発明の「ローリングサークル増幅により増幅してコンカテマーを形成する工程、ここで、コンカテマーは、環状核酸鋳型配列のタンデムリピートユニットを含む」に相当する。また、引用発明の「(c)前記コンカテマーを、目的とする配列を持つ送達ユニットを一つ含む小さいフラグメントに切断する工程と、(d)小さい環状フラグメントを得るために前記小さいフラグメントの端部をライゲーションする工程」と、本願発明の「コンカテマーを、部位特異的組換えを媒介可能なタンパク質とインキュベーションして、環状核酸を生成する工程」は、ともに、コンカテマーから環状核酸を生成する工程であるといえる。
したがって、本願発明と引用発明は、「環状核酸をin vitroで生成する方法であって、該方法は:1種類の環状核酸鋳型を提供する工程;環状核酸鋳型をローリングサークル増幅により増幅してコンカテマーを形成する工程、ここで、コンカテマーは、環状核酸鋳型配列のタンデムリピートユニットを含む;および、コンカテマーから環状核酸を生成する工程、を含む、前記方法。」である点で一致し、次の点で相違する。
相違点: 本願発明では、「環状核酸鋳型」が「部位特異的組換え部位」を含んでおり、「コンカテマーから環状核酸を生成する工程」が「コンカテマーを、部位特異的組換えを媒介可能なタンパク質とインキュベーションして、環状核酸を生成する工程、を含み、部位特異的組換えを媒介可能なタンパク質は、Creリコンビナーゼまたは酵母Flpリコンビナーゼから選択される」ものであるのに対して、引用発明では、「環状核酸鋳型」が「部位特異的組換え部位」を含むことは特定されておらず、「コンカテマーから環状核酸を生成する工程」が「(c)前記コンカテマーを、目的とする配列を持つ送達ユニットを少なくとも一つ含む小さいフラグメントに切断する工程と、(d)小さい環状フラグメントを得るために前記小さいフラグメントの端部をライゲーションする工程」である点。

(3)判断
上記相違点について検討すると、引用文献2の段落【0031】には、「環状鋳型」を「増幅」して得られた「核酸産物」、すなわちコンカテマーに、「更なる処理」を施して「環状あるいはスーパーコイル化された核酸」を得るための二つの実施態様が記載されているところ、一つめの実施態様は「増幅に続くDNAリガーゼを用いたライゲーション工程を含み、環状核酸(CNAs)を形成する。」というものであり、二つめの実施態様は、「リコンビナーゼあるいは同様な酵素を用いて送達ユニットを円形にして環状核酸とする。」というものである(上記(摘記4))。ここで、上記一つめの実施態様は、引用発明の工程(c)及び(d)に相当することから、引用発明の工程(c)及び(d)、すなわち、本願発明との相違点に当たる工程は、上記二つめの実施態様に変更できることが理解される。そして、上記二つめの実施態様で用いられる「リコンビナーゼ」とは、一般に、DNA分子の決まった部位に結合して、対合した特定の塩基配列の部位(部位特異的組換え部位)でDNA鎖を切断し、切断末端を交換して再結合することにより、部位特異的な組換えを行う組換え酵素のことであって、Creリコンビナーゼや酵母Flpリコンビナーゼが代表例であること、及び、Creリコンビナーゼや酵母Flpリコンビナーゼを人為的な組換えに使用する際には所望の位置に部位特異的組換え部位を含ませる必要があることは、本願優先日当時の技術常識である(必要であれば、「岩波 生物学辞典 第4版」(1996年3月21日岩波書店発行)第348ページ「組換え遺伝子」の項、引用文献3の図3c、引用文献4の要約、及び引用文献5の図1(a)を参照のこと。)。
そうすると、引用発明の本願発明との相違点に当たる工程(c)及び(d)を上記二つめの実施態様に変更すること、具体的には、環状核酸鋳型を部位特異的組換え部位を含むものとして、コンカテマーを、部位特異的組換えを媒介可能なタンパク質として周知のCreリコンビナーゼまたは酵母Flpリコンビナーゼとインキュベーションして、環状核酸を生成することは、当業者が引用文献2の記載事項及び周知技術に基づいて容易に想到し得たことであるといえる。そして、そうすることにより、引用発明の工程(c)及び(d)という2工程の代わりに、リコンビナーゼとのインキュベーションという1工程で済むことは引用文献2の記載事項及び周知技術から予測し得る範囲内のことであるし、その他に格別顕著な効果が奏されるとも認めることができない。
したがって、本願発明に進歩性を認めることはできない。

(4)請求人の主張について
請求人が令和3年10月20日付け意見書においてする主張とそれに対する合議体の判断は、次のとおりである。
ア 請求人の主張
(ア) 引用文献2においてリコンビナーゼの使用は1行記載として記載されているに過ぎず、実施可能であることは証明されていない。まして「部位特異的」組換えであることが特定されていないのだから、Creリコンビナーゼ及び酵母Flpリコンビナーゼを用いるように変更することは容易ではない。
(イ) 本願出願時、多くの組換え部位を含むコンカテマーから、リコンビナーゼを使用して、1つの組換え部位を有するモノマー環状核酸を作製することが実際に可能かどうかは自明ではなく、当業者は目的DNA配列を複数コピー含有する多量体環状核酸が産生されると予測するところ、本願発明では、実施例1に示すとおり、予想外に目的DNA配列を一つだけ含有するモノマー環状核酸を効率よく生成することができた。

イ 判断
(ア)上記主張(ア)について
上記(3)で指摘したとおり、引用文献2には、リコンビナーゼの使用が、引用発明の工程(c)及び(d)の代替方法であると理解できるように記載されているうえ、リコンビナーゼとは、一般に、部位特異的組換えを行う、Creリコンビナーゼや酵母Flpリコンビナーゼのような組換え酵素を指すことが技術常識である(必要であれば、「岩波 生物学辞典 第4版」(1996年3月21日岩波書店発行)第348ページ「組換え遺伝子」の項)のだから、実施可能であることの証明の有無にかかわらず、引用文献2に接した当業者にとって、Creリコンビナーゼや酵母Flpリコンビナーゼを使用するように変更してみることはごく自然な発想である。
したがって、請求人の上記主張(ア)は採用の限りでない。
(イ)上記主張(イ)について
上記(3)で指摘したとおり、引用文献2には、リコンビナーゼの使用が、引用発明の工程(c)及び(d)の代替方法であると理解できるように記載されているのだから、当業者であれば、リコンビナーゼを使用して、引用発明の目的物である「環状鋳型と同一の高品質核酸」、すなわち、目的DNA配列を一つだけ含有するモノマー環状核酸を生成できると理解するものと認められる。
一方、請求人が指摘する本願実施例1の結果を検討すると、図2には、本願発明の方法で生成したDNA(pUC/LoxP−RCA/Cre)、環状鋳型DNA(puc18−環状)、その他のDNA(puc18−RCA、puc18−RCA/Cre、及びpUC/LoxP−RCA。これら3種はいずれもコンカテマーであると認められる。)によるNM522細胞の形質転換効率(形質転換体/マイクログラム)が記載されているところ、本願発明の方法で生成したDNAの形質転換効率は、コンカテマーよりは高いものの、環状鋳型DNAの3分の1程度でしかない。また、図3には、FBβ細胞を用いて同様に行った実験の結果が記載されているところ、本願発明の方法で生成したDNAの形質転換効率は、コンカテマーよりは高いものの、環状鋳型DNAの2分の1程度でしかない。
請求人が意見書で説明するとおり、1つの組換え部位を有するモノマー環状核酸しか形質転換が行えないとすると、図2及び3の結果は、本願発明の方法で生成したDNAはモノマー環状核酸をせいぜい3分の1〜2分の1程度しか含有していないと理解でき、これが引用文献2の記載から予測しうる範囲を超えるほど顕著に高い効率であるとまでは認めることができない。
したがって、請求人の上記主張(イ)も採用することができない。

第5 むすび
以上のとおり、本願発明は、特許法第29条第2項の規定により特許を受けることができないものであるから、その余について検討するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。
よって、結論のとおり審決する。
 
別掲 (行政事件訴訟法第46条に基づく教示) この審決に対する訴えは、この審決の謄本の送達があった日から30日(附加期間がある場合は、その日数を附加します。)以内に、特許庁長官を被告として、提起することができます。

審判長 中島 庸子
出訴期間として在外者に対し90日を附加する。
 
審理終結日 2022-03-08 
結審通知日 2022-03-14 
審決日 2022-03-29 
出願番号 P2018-088777
審決分類 P 1 8・ 121- Z (C12P)
最終処分 02   不成立
特許庁審判長 中島 庸子
特許庁審判官 松野 広一
長井 啓子
発明の名称 DNAミニサークルおよびその使用  
代理人 田中 研二  
代理人 田中 研二  
代理人 崔 允辰  
代理人 飯田 雅人  
代理人 中西 基晴  
代理人 崔 允辰  
代理人 飯田 雅人  
代理人 中西 基晴  

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