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審決分類 審判 一部申し立て 2項進歩性  C12N
審判 一部申し立て 特36条4項詳細な説明の記載不備  C12N
審判 一部申し立て 特36条6項1、2号及び3号 請求の範囲の記載不備  C12N
管理番号 1386189
総通号数 7 
発行国 JP 
公報種別 特許決定公報 
発行日 2022-07-29 
種別 異議の決定 
異議申立日 2022-03-07 
確定日 2022-07-04 
異議申立件数 1 
事件の表示 特許第６９３３８９８号発明「養子細胞治療製品を製造するための誘導多能性幹細胞の適用」の特許異議申立事件について、次のとおり決定する。 
結論 特許第６９３３８９８号の請求項８ないし１１に係る特許を維持する。 
理由 第１ 手続の経緯
１．本件特許の登録までの経緯
特許第６９３３８９８号（請求項の数１３。以下、「本件特許」という。）は、平成２７年４月２４日（パリ条約による優先権主張 ２０１４年４月２４日 アメリカ合衆国（US））を国際出願日とする特願２０１６−５６３９３７号の請求項１〜１３に係る発明について、令和３年８月２４日に特許権の設定登録がされ、特許掲載公報が令和３年９月８日に発行されたものである。

２．本件特許異議申立ての趣旨
本件特許につき令和４年３月７日に、本件特許の請求項８〜１１に係る特許に対して、特許異議申立人である勝野賢一（以下、「申立人」という。）より、「特許第６９３３８９８号の特許請求の範囲の請求項８〜１１に記載された各発明は取り消されるべきものである。」という趣旨の本件特許異議の申立てがされた。
よって、本件特許異議申立てに係る審理対象は、請求項８〜１１に係る特許についてであり、請求項１〜７，１２〜１３に係る特許は、審理対象外である。


第２ 本件発明
本件特許第６９３３８９８号の請求項８〜１１の特許に係る発明は、それぞれ、その特許請求の範囲の請求項８〜１１に記載された事項により特定されるとおりのものである（以下、請求項８に係る発明〜請求項１１に係る発明を、項番に従い、「本件発明８」〜「本件発明１１」といい、それらを総称して、「本件発明」という。また、本件特許の設定登録時の願書に添付した明細書を「本件明細書」という。）。

「【請求項８】
少なくとも１つのセットのホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子及びＨＬＡ−Ａｎｅｇ表現型を含む、哺乳動物人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）。
【請求項９】
ｉＰＳＣはホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子、ホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子またはホモ接合ＨＬＡ−Ｃ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子を含む、請求項８に記載のｉＰＳＣ。
【請求項１０】
前記ｉＰＳＣはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む、請求項８〜９のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣの集団。」


第３ 申立人が申し立てた特許異議申立理由
申立人が申し立てた特許異議申立の理由（以下、「申立理由」という。）の概要及び証拠方法は以下のとおりである。

１．申立理由の概要
（１）申立理由１（進歩性）
本件発明８〜１１は、甲第１〜５号証（主引例 甲第１号証）に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法第29条第2項の規定に違反するから、特許法第113条第2号に該当し、取り消されるべきものである。

（２）申立理由２（進歩性）
本件発明８〜１１は、甲第１〜５号証（主引例 甲第５号証）に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法第29条第2項の規定に違反するから、特許法第113条第2号に該当し、取り消されるべきものである。

（３）申立理由３（進歩性）
本件発明８〜１１は、甲第１〜５号証（主引例 甲第２号証）に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法第29条第2項の規定に違反するから、特許法第113条第2号に該当し、取り消されるべきものである。

（４）申立理由４（実施可能要件）
本件明細書の発明の詳細な説明には、「少なくとも１つのセットのホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子」を含み、「HLA-Aneg」であるiPSCの作製やその効果は何ら示されていない。
したがって、本件特許は、実施可能要件を充足せず、特許法第36条第4項第1号の規定を満たしていない特許出願に対してされたものであるから、特許法第113条第4号に該当し、取り消されるべきものである。

（５）申立理由５（サポート要件）
本件特許発明の課題は、HLA-Aの発現を除去し、かつ、HLAをホモ接合とすることで、より多くの患者に免疫学的適合性を有する細胞を提供することにあると認められる。
しかしながら、当業者であっても、発明の詳細な説明の記載からは、HLA-Anegで、かつ、HLA-B、HLA-C、及びHLA-DRB1がすべてホモ接合である場合以外において、上記課題が解決されることは理解できないから、発明の詳細な説明には、本件特許発明の全般にわたって、発明の課題が解決されることを当業者が認識できるように記載されていない。
したがって、本件特許は、サポート要件を充足せず、特許法第36条第6項第1号の規定を満たしていない特許出願に対してされたものであるから、特許法第113条第4号に該当し、取り消されるべきものである。

２．証拠方法
甲第１号証：Taylor et al. "Generating an iPSC Bank for HLA-Matched
Tissue Transplantation Based on Known Donor and
Recipient HLA Types" Cell Stem Cell, 2012, 11(2),
pp147-152（2012年8月3日公開）、及び抄訳
甲第２号証：Torikai et al. "Toward eliminating HLA class I
expression to generate universal cells from allogeneic
donors" Blood, 2013, 122(8), pp1341-1349
（2013年8月22日公開）、及び抄訳
甲第３号証：Torikai et al., "ZFN-Driven Gene Editing Prevents HLA-A
Expression On Hematopoietic Stem Cells -Improving The
Chance Of Finding An HLA-Matched Donor" Blood, 2013,
122(21), 1655*（2013年11月15日公開）、及び抄訳
甲第４号証：Riolobos et al., "HLA Engineering of Human Pluripotent
Stem Cells" Mol Ther. 2013, 21(6), pp1232-1241
（2013年6月1日公開）、及び抄訳
甲第５号証：特表２０１３−５０１５０５（2013年1月17日公表）
甲第６号証：Torikai et al., "Genetic editing of HLA expression in
hematopoietic stem cells to broaden their human
application" Scientific Reports, 2016, 23(6), pp1-11,
（2016年2月23日公開）、及び抄訳
甲第７号証：本件特許の審査過程において提出された令和2（2020）年3月
4日付 手続補正書（審判請求書「請求の理由」の補充）
（以下、「甲第１号証」〜「甲第７号証」を「甲１」〜「甲７」という。）


第４ 当審の判断
当審は、申立人が主張する上記の申立理由は、いずれも理由がなく、ほかに各特許を取り消すべき理由も発見できないから、本件発明８〜１１に係る特許は、いずれも取り消すべきものではなく、維持すべきものと判断する。

１．本件明細書に記載された事項
本件明細書の発明の詳細な説明には、以下の事項が記載されている。

本ａ．
「【背景技術】
【０００６】
自家またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が適合した同種異系ドナー細胞を使用した細胞療法は、がんを含む多種の疾患、及び再生医療にとって有望な治療法である。しかし、自家細胞は、時には、特にがん患者において疾患自体または毒性のある薬の反復投与を原因とする機能的な欠陥がある。同種異系細胞の場合、患者は、同種異系の免疫応答を回避するために、適切なＨＬＡ適合ドナーを見つける必要がある。例えば、同種異系造血幹細胞（ＨＳＣ）は、レシピエントのＨＳＣの不在または機能不全を回復させるために注入され、特異的造血細胞を生成するための供給源として提供される。しかし、ＨＬＡ系の多様性は、ＨＬＡ適合ドナーを見つけることのハードルとなり、そのハードルは人種的な遺伝子多型の影響によって増長される。適切なＨＬＡ適合産物を患者に提供するために、ロバストなドナー数が必要とされる。臍帯血（ＵＣＢ）単位の事前バンク及び国立骨髄ドナープログラム（ＮＭＤＰ）を通じて登録された成人ドナーにアクセスするにもかかわらず、多くのレシピエント、特にドナープールに不足している人種及び民族マイノリティのレシピエントにとって、適切なＨＬＡ適合産物を見つけることは困難なままである。実際には、ＮＭＤＰに登録されているドナー９００万人では米国の人口をカバーするのに十分ではない。さらに、細胞治療製品を準備するために大幅な時間及び金銭的費用がかかる。このように、同種異系の免疫細胞媒介性拒絶反応を回避し、患者からの細胞培養物を増やす必要なく患者に注入することができる細胞製品が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、免疫療法、再生医療の養子細胞治療製品を製造するための人工多能性幹細胞の適用、及び免疫受容体の潜在毒性のスクリーニングを提供している。
【０００８】
一態様では、ＨＬＡ−Ａｎｅｇ、ＨＬＡホモ接合人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を製造する方法を提供し、（ａ）ＨＬＡホモ接合ドナーから細胞の集合を得て、（ｂ）ＨＬＡ−Ａを発現しないように前記細胞を操作し、それによってＨＬＡ−Ａｎｅｇ細胞を製造し、及び（ｃ）ｉＰＳＣを生成するように前記ＨＬＡ−Ａｎｅｇ細胞をリプログラムし、それによってＨＬＡ−ＡｎｅｇｉＰＳＣを製造することを含む。
【０００９】
一態様では、細胞集団は臍帯血細胞の集団であってもよい。一態様では、ドナーはＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１のＨＬＡ−ホモ接合であってもよい。
【００１０】
いくつかの態様では、ＨＬＡ−Ａが発現しないように細胞を操作することは、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座を特異的に標的とする人工ヌクレアーゼを前記細胞に導入することを含んでもよい。様々な態様では、人工ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であってもよい。様々な態様では、人工ヌクレアーゼを細胞に導入することは、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを細胞に導入することを含んでもよい。
【００１１】
いくつかの態様では、リプログラミング細胞（例えばＨＬＡ−Ａｎｅｇ細胞）はＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、Ｋｌｆ４、ｍｙｃ（例えば、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、または形質転換が欠損しているｍｙｃ変異体）及び／またはＳＶ４０ＬＴから成る群から選択されるリプログラミング因子を細胞に導入することを含んでもよい。いくつかの態様では、例えば、ＨＬＡ−Ａｎｅｇ細胞等のリプログラミング細胞は、リプログラミング因子Ｏｃｔ３／４、ＫＬＦ４、Ｓｏｘ２、及びｃ−ｍｙｃタンパク質を細胞に導入することを含む。さらなる態様では、リプログラミングは、Ｏｃｔ３／４、ＫＬＦ４、Ｓｏｘ２、及びｍＲＮＡをコードするｃ−ｍｙｃを細胞に導入することを含んでもよい。さらに別の態様では、リプログラミングは、Ｏｃｔ３／４、ＫＬＦ４、Ｓｏｘ２、及びｃ−ｍｙｃをコードする１つまたは複数の発現カセットを細胞に導入することを含んでもよい。１つまたは複数の発現カセットは、１つまたは複数のエピソームベクターに含まれてもよい。１つまたは複数の発現カセットは、１つまたは複数のウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはセンダイウイルスベクター）に含まれてもよい。」

本ｂ．
「 Ｉ．実施形態の態様
【００４２】
本明細書は、大規模な患者集団に適用可能な養子細胞治療製品を製造するための人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ細胞）の適用を記載している。（例えば免疫受容体の）潜在毒性をスクリーニングするための当該ｉＰＳＣの使用も記載している。本明細書で詳しく説明している細胞によって、広範囲の疾患の治療に使用される治療薬がもたらされる。特に、前記細胞は治療を受けることができる以上のより広範囲の患者集団に使用しても差し支えない改変されたＨＬＡ遺伝子を含む。特定の態様では、実施形態の細胞は、ＨＬＡ対立遺伝子の１つまたは複数のペアにホモ接合性であり、ＨＬＡ−Ａｎｅｇ表現型を含む。これらの特徴によって、前記細胞を多数の患者にとって有効な免疫適合性のある細胞にし、それによって個別の患者のために開発された治療法よりはるかに低コストで生み出すことができる細胞ベースの治療法を提供する。
【００４３】
図３に示すように、ｉＣａｓｐ９＋ＨＬＡ−Ａｎｅｇ細胞等のＨＬＡ−Ａｎｅｇ細胞は、ＨＬＡ−Ａコード遺伝子の選択的崩壊によってＨＬＡホモ接合細胞から生成することができる。例えば、ｉ）ｉＣａｓｐ９遺伝子（またはその他の自殺遺伝子）を導入するためのスリーピングビューティー（ＳＢ）トランスポゾン／トランスポサーゼ系（またはその他の遺伝子導入方法）、及びｉｉ）ＨＬＡ−Ａを除去するためのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはその他の人工ヌクレアーゼ（例えばＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）で遺伝子改変されることによるＨＬＡホモ接合臍帯血細胞。これらの細胞は、リプログラミング因子を導入する（例えばＯｃｔ３／４、ＫＬＦ４、Ｓｏｘ２、及びｃ−ｍｙｃをコードするセンダイウイルスを使用する）ことによってｉＰＳＣにリプログラムすることができる。あるいは、ｉＰＳＣクローンをＳＢ及びＺＦＮで直接的に遺伝子改変し、言い換えれば、前記細胞をまずリプログラムし、その後遺伝子改変してもよい。遺伝的にセーフハーバープロファイルを有することが確認されているｉＰＳＣクローンを単離した後に、前記細胞を系譜特異的な細胞に分化することができ、当該細胞を免疫治療及び／または再生医療のために患者に投与してもよい。ｉＰＳＣを分化するための１つのアプローチは、遺伝子改変されたＫ−５６２細胞に由来する細胞等の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の使用を伴う。
【００４４】
Ａ．ＨＬＡ−ＡｎｅｇＨＬＡ−ホモ接合性ｉＰＳＣの生成及びその使用方法
【００４５】
本発明の実施形態は、免疫療法及び再生医療のための同種異系細胞治療のための同種異系ｉＰＳＣバンクを提供する。事前準備されオンデマンド注入することができる特徴を有した製品を製造することは、利用可能というより必要なときに、集中的に製造し、細胞ベースの治療を送達することができる大きな魅力を有している。さらに、ｉＰＳＣの遺伝子操作及びクローンの特徴付けによって、下流の臨床グレード製品を製造することが可能になる。この技術によって、臨床医が同種異系治療用細胞をオンデマンドで注入する治療プロセスが促進され、ドナー間異種性が減少し、また、細胞治療製品を調製するコストを低減する。
【００４６】
既存のドナープールへのアクセスを改善する方法は、臨床的影響を与えることが予想される。実際に、国立骨髄ドナープログラム（ＮＭＤＰ）は、米国で約１万人の患者が血縁関係のない同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の恩恵を受けることができると試算している。同種異系ＨＳＣがＨＬＡ−Ａ遺伝子座の発現を排除するように遺伝的に編集されれば、既に登録されているドナーの臨床適用が著しく増加すると思われる。ＮＭＤＰのモデリングによると、ＨＬＡ−Ａ適合の必要性がなくなり、ＨＬＡ−Ｂ、−Ｃ、及び−ＤＲのみに適合すれば、アフリカ系アメリカ人のレシピエントがＨＬＡ適合ドナーを見つける機会が１８％から７３％に増加することが示されている。操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（または例えばＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９といったその他の人工ヌクレアーゼ）は、遺伝的に編集されたＴ細胞及び細胞株中のＨＬＡ−Ａ発現を排除することができる。ＺＦＮを使用してＨＳＣ中のＨＬＡ−Ａ発現を排除することによって、ＨＬＡ適合ドナーを見つける機会が増える魅力的な方法が提供される。このことによって、特に少数民族に属する患者にとって同種異系ＨＳＣＴの臨床適用を広げることが予想される。
【００４７】
ＨＬＡ−ＡｎｅｇＨＬＡホモ接合ｉＰＳＣのバンクの作成が、複数のレシピエントに注入することができるため、これらの問題を解決する。前記バンクの作成は、臍帯血に由来するｉＰＳＣ等の（表１参照、ＨＬＡ−Ｂ、−Ｃ、及び−ＤＲＢ１がホモ接合の）約２７名の固有のドナーから、（例えばデザイナージンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して）ＨＬＡ−Ａをノックアウトすることによって達成することができる。これらのｉＰＳＣバンクは免疫治療及び再生医療を改善するために遺伝子を挿入する、及び削除するように操作することができる。これらのＨＬＡ−ＡｎｅｇｉＰＳＣ及びそれから分化された細胞（例えば免疫細胞、心細胞、腎細胞）は、免疫細胞ならびにその他の治療用細胞、例えば、限定されないが、サブタイプを含む心細胞、膵臓、腎臓、ＮＫ細胞、ｉＮＫＴ細胞、及びＴ細胞を生成するために使用することができる非常に価値のあるリソースになる。これは、疾患（例えばがん、自己免疫疾患、感染症）の治療及び再生医療を生み出す。」

本ｃ．
「【実施例】
【０１９９】
ＶＩ．実施例
・・・・
【０２０１】
実施例１：ＨＬＡ−Ａｎｅｇ造血幹細胞の生成
同種異系ＨＳＣがＨＬＡ−Ａ遺伝子座の発現を削除するように遺伝的に編集されれば、登録されているＮＭＤＰドナーの臨床使用を著しく増加させることができる。操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（または人工ヌクレアーゼ、例えばＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）は、遺伝的に編集されたＴ細胞及び細胞株のＨＬＡ発現を削除するために使用することができる。造血幹細胞（ＨＳＣ）への遺伝子編集を拡張するために、ＨＬＡ−Ａの遺伝子座を標的とするＺＦＮを導入することによって、ＨＬＡ−Ａ発現を崩壊させた。ＣＤ３４＋系統ｎｅｇＨＳＣ（純度９９％）を、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ６１、及びＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）に対するビオチン化抗ヒト抗体の混合物を使用して系譜ｐｏｓ細胞を最初に枯渇させ、ビオチン結合常磁性ビーズを使用して枯渇させて臍帯血（ＵＣＢ）から単離した。次に、ＣＤ３４＋細胞を抗ＣＤ３４磁気ビーズを用いて単離した。ＨＬＡ−Ａ特異的ＺＦＮをコードするｉｎ ｖｉｔｒｏに転写されたｍＲＮＡ種の電気泳動転写によって、既定のサイトカイン（ＦＬＴ３−Ｌ、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＩＬ−６）及びアリール炭化水素受容体アンタゴニスト（ｓｔｅｍ ｒｅｇｉｎｉｎ−１、ＳＲ−１）でｅｘ ｖｉｖｏ培養してから１週間後に、ＨＬＡ−ＡｎｅｇＨＳＣが３０％生成した。ＤＮＡ配列分析は、ＨＬＡ−ＡｎｅｇＨＳＣがＺＦＮ標的部位で期待されたヌクレオチド変化を示すことを明らかにした。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイはＨＬＡ−ＡｐｏｓＨＳＣとＨＬＡ−ＡｎｅｇＨＳＣとの間の系譜特異的コロニー形成に有意な差を示さなかった。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏ生着アッセイはＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスを使用し、操作されたＨＬＡ−ＡｎｅｇＨＳＣが生着及びＨＬＡ−Ａｎｅｇ多系譜造血細胞に分化する能力を維持していることを示した。
【０２０２】
実施例２：ＨＬＡ−ＡｎｅｇｉＰＳＣの生成
必要なドナーの数を最小化する一つの方法として、ＨＬＡ−ホモ接合ドナーから１つのＨＬＡ遺伝子座を削除してもよい。ドナー細胞からのＨＬＡ−Ａ除去が適切なＨＬＡ適合ドナーを見つける確率（図１）に有意な影響を有し得ることが判明した。したがって、ＨＬＡホモ接合ドナーからＨＬＡ−Ａ発現を排除することによって、ＨＬＡ適合患者に注入することができるバンクされたｉＰＳＣの必要数が減少する。不必要な同種異系免疫反応を引き起こす内在性ＴＣＲαβ及びγδ発現のさらなる削除を移植片対宿主病を減少させるために実施してもよい。ｉＰＳＣはさらに、疾患及び再生医療のための同種異系ｉＰＳＣ治療の安全性を確保するために自殺遺伝子（例えばｉＣａｓｐ９、誘導性カスパーゼ９）を発現するようにさらに改変することができる。全ゲノム配列決定及び統合部位の分析（例えば導入遺伝子の発現が維持され、内因性遺伝子の発現を崩壊させない統合部位）によってアッセイされるように、「セーフハーバー」遺伝子プロファイル（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕら、２０１１、参照により本明細書に援用される）を有するｉＰＳＣクローンを単離する。この自殺遺伝子＋、ＴＣＲｎｅｇ、ＨＬＡ−Ａｎｅｇ、ＨＬＡホモ接合ｉＰＳＣバンクは、広い範囲の患者に有用な同種異系細胞産物を調製するために使用することができる。このｉＰＳＣバンクは治療可能性を向上し、多数のレシピエントに投与するための細胞の開始プールを有効にする。これらのｉＰＳＣの一つの有力な即時使用は、ｉ）免疫治療のために腫瘍またはウイルス特異性免疫受容体（例えばＴＣＲαβまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ））を発現する免疫細胞（Ｔ細胞（Ｔｈｅｍｅｌｉら、２０１３）、ＮＫ細胞（Ｋｎｏｒｒら、２０１３）、ＮＫＴ細胞等を含む）であり、ｉｉ）血液系腫瘍または先天性障害のための造血幹細胞移植である。さらに、同種異系ｉＰＳＣは、例えば再生医療のための心筋細胞、肺上皮細胞、腎細胞、及び神経細胞を生成するために使用することができる。ｉＰＳＣはまた、クローニング及び強固な増殖のために比較的高い効率で安全に細胞操作を行うために使用することもできる。例えば、ｉＰＳＣは治療用遺伝子（例えばＣＡＲ）を発現させるために改変することができ、人工ヌクレアーゼ（例えばＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）によって遺伝的に編集し、免疫抑制分子（例えばＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＣＲアルファ定常領域）を削除することもできる。
【０２０３】
センダイウイルスベクター媒介性遺伝子のＴ細胞への導入。ＨＬＡホモ接合ＵＣＢ（表２）に由来するＴ細胞からｉＰＳＣを生成するためにセンダイウイルスベクターを使用した。まず、ＧＦＰレポーター遺伝子を有するＳｅＶベクターを用いて、ＳｅＶの有効性をＴ細胞で試験した。抗ＣＤ３モノクロナール抗体（ｍｏＡｂ）及び抗ＣＤ２８ ｍｏＡｂでＴ細胞を活性化してから２日後に、細胞をＧＦＰ−ＳｅＶ粒子に感染させた。ＳｅＶからのＧＦＰ発現は非常に高く、その発現は１週間後も維持された（トランスフェクトされていないＴ細胞よりＭＦＩが約３ｌｏｇも高い）（図４）。
【表２】

【０２０４】
ＨＬＡホモ接合ＵＣＢに由来するＴ細胞からのｉＰＳＣの生成。ＨＬＡホモ接合ＵＣＢユニットをＭＤアンダーソンがんセンターの臍帯血バンクから入手した。１つの方法では、Ｔ細胞を単離後、ｉ）ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２（ポリシストロン性ベクター）、ｉｉ）ｃＭＹＣ、及びｉｉｉ）ＭＯＩのＫＬＦ４（それぞれ５、５、３）をコードするＳｅＶベクターを当該細胞に感染させた。ＭＥＦフィーダー培地またはＭａｒｉｇｅｌ上で１２日後に、ｉＰＳコロニーが出現し、これらのコロニーを１６日目にＴＲＡ−１−６０染色を用いて評価した（図５）。ＭＥＦフィーダー条件での初期誘導の後、ｉＰＳＣをｍＴｅＳＲ１培地でフィーダーのない（Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングされた）プレートでさらに培養した。ｉＰＳＣはこの条件下で多能性細胞様の形態を維持し、ｉＰＳＣによる多能性マーカーの発現を免疫経口染色で確認した（図６）。
【０２０５】
ＤＮＡプラスミドのエレクトロポレーションまたはｉＰＳＣへのｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏの転写。スリーピングビューティートランスポゾン／トランスポザーゼ系をがんに対する養子免疫療法のためのＴ細胞を発現するキメラ抗原受容体を生成するために適用した。この系はウイルスベースの遺伝子改変よりもはるかに安価である。この系はヌクレオフェクションによってＤＮＡプラスミド（またはｍＲＮＡ）のトランスフェクションに依存するため、ＣＭＶプロモーター駆動ＧＦＰをコードするＤＮＡ及びＧＦＰをコードするｍＲＮＡでｉＰＳＣのヌクレオフェクションの試験を行った。４Ｄ Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｇｒａｍ：ＣＡ−１３７）を用いて、ＤＮＡプラスミド及びｍＲＮＡをｉＰＳＣに導入した（図７）。ストリップを使用して、小規模のトランスフェクション（２０μＬ）を使用したときに、高いトランスフェクション効率を達成した。
【０２０６】
ジンクフィンガーヌクレアーゼによるＴＲＡＣ遺伝子の崩壊。図８は、ｍＲＮＡをコードしたジンクフィンガーヌクレアーゼのトランスフェクションによってＴＲＡＣ遺伝子（ＴＣＲアルファ定常領域）を崩壊するための例示的なプロトコルを提供している。ＴＲＡＣ遺伝子が崩壊したｉＰＳクローンを単離し、崩壊したＴＲＡＣ遺伝子を有するクローンを同定するために、ゲノムＤＮＡ配列決定によって分析した（図９）。ＴＲＡＣ遺伝子が崩壊したｉＰＳクローンがＯＣＴ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１を含む多能性マーカーを発現することが見いだされた。
【０２０７】
ジンクフィンガーヌクレアーゼによるＴＣＲ遺伝子の崩壊。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＴＣＲ遺伝子がｉＰＳ細胞であることを妨害するために一本鎖のドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）と組み合わせて使用した（Ｃｈｅｎら、２０１１）。液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）（Ｍｉｙａｋｏａら、２０１４）（図１０）を用いて変異体をスクリーニングした。
【０２０８】
ＣＡＲの導入。スリーピングビューティー及びレンチウイルスを用いてＣＡＲの導入を実施した（図１１）。ＳＢ媒介ＣＡＲ伝達はｉＰＳ細胞のレンチウイルス媒介ＣＡＲ形質導入に匹敵することが見出された（図１２）。ｉＰＳ細胞の分化または死亡を誘導された抗ＦＣによる正の選択（ＩｇＧ茎でＣＡＲを検出）をＣＡＲ＋集団を増やすために使用してもよい。
【０２０９】
ｉＰＳ細胞からのＴ細胞の再分化。図１３はフィーダーフリーの条件下でｉＰＳ細胞から造血前駆細胞（ＨＰＣ）の分化のための例示的なプロトコルを提供する。」

２．甲各号証の記載事項及び主引例となる甲各号証に記載された発明
甲１〜４は英文であるため、申立人が提出した甲１〜４の抄訳を参考にして、当審で作成した訳文を甲１〜４の記載事項として示す。

ア．甲１の記載事項及び甲１に記載された発明
（ア）甲１の記載事項
甲１ａ
「既知のドナーおよびレシピエントのHLA型に基づくHLA適合組織移植用iPS細胞バンクの作製

ヒト白血球抗原（HLA）不一致の人工多能性幹細胞（iPSC）における免疫学的拒絶反応の可能性は、治療の可能性を制限する。本稿では、150人の選択されたホモ接合HLA型ボランティアの組織バンクが英国人口の93％に適合でき、免疫抑制を最小限にする要求を満たすことを示す。このモデルは、既存のHLA型サンプルを用いて、多数の個人のタイピングを回避するiPSC幹細胞バンクを構築するための実用的なアプローチを提供する。」 （p147、標題、冒頭概要）

甲１ｂ
「HLA遺伝子型は集団内で大きく変動するため、意図するレシピエントの大多数に対して臨床的に有益なHLAの適合を達成するためには、数千人のランダムドナーのバンクが必要となるであろう。これは現実的ではないので、代替的なアプローチは、ホモ接合HLA型を有する限られた数の高度に選択された細胞ドナーを含むiPSCバンクを作り、潜在的レシピエントの大多数に対してHLAの適合を可能にすることである (Taylor et al., 2005)。臓器移植や臍帯血移植の経験から、適合すべき最も重要なHLA遺伝子座はHLA-A、-B、-DRであり(Opelz and Dohler, 2007; Johnson et al., 2010; Kurtzberg et al., 2008)、これらの遺伝子座への適合により、同種異系移植片拒絶の発生率と外来免疫抑制の必要性が減少することが分かっている(Taylor et al., 1993; Opelz and Dohler, 2010a, Opelz and Dohler, 2010b)」 （p147、中欄3-24行）

甲１ｃ
「バンキングに最適なiPSCドナー候補の同定
次に我々は、Bone Marrow Donors Worldwide (BMDW) (http://www.bmdw.org)に登録されている1700万人以上のHLA型ボランティア幹細胞ドナーを調査し、上記の405種類の理論的ホモ接合型HLAの組み合わせのうち、実際に存在するものを特定した。このドナーには、原則として、英国人口のHLA-A、-B、-DRミスマッチゼロを達成すべく、将来iPSCバンクへ組織を提供できる人が含まれている。実用的な目的と、ドナーが血液型O型（ユニバーサルドナー）である可能性を最大限に高めるために、理論上の405種類のHLAの組み合わせが、1700万人のボランティアの中でそれぞれ少なくとも10回以上存在することが必要であった。405通りの理論的HLAの組み合わせのうち236通り（58.3%）のHLAホモ接合体潜在的iPSCドナーが少なくとも10人見つかり、これらは英国レシピエントの95.48%に対してミスマッチゼロを提供した（図1B）。同定された236種類のうち上位150種類のホモ接合型HLAは、英国の潜在的レシピエントの93.16%にHLAミスマッチをゼロにし、最も頻度の高いホモ接合型HLAドナーでは最大19398人、最小10人のドナーが存在することになった。最高ランクのホモ接合型HLAを持つiPSCを50株でも集めた幹細胞バンクは、英国の潜在的レシピエントの79%に対してHLAミスマッチをゼロにすることができる；これらを表1に示した。英国の潜在的レシピエント集団にゼロHLA-A、-B、-DRミスマッチを提供するために有用性の降順にランク付けされた236のホモ接合型HLA型の全リストは、表S2Bとして見ることができる。」（p148右欄下から7行〜ｐ149左欄下から9行）

甲１ｄ
「表1.潜在的UKレシピエント1万人のうち79%にHLAミスマッチゼロとなる、BMDWレジストリに登録されている上位50のホモ接合HLA-A、-B、-DR型」 （p150、Table 1）

（イ）甲１に記載された発明（甲１発明）の認定
甲１は、「既知のドナーおよびレシピエントのHLA型に基づくHLA適合組織移植用iPS細胞バンクの作製」に関するものであって（甲１ａ）、甲１には、「ホモ接合HLA型を有する限られた数の高度に選択された細胞ドナーを含むiPSCバンク」が「潜在的レシピエントの大多数に対してHLAの適合を可能にする」ことが記載され（甲１ｂ）、ホモ接合HLA型ボランティアの組織バンクが英国人口の93％に適合でき、免疫抑制を最小限にする要求を満たすこと（甲１ａ）、HLA遺伝子座HLA-A、-B、-DRへの適合により、同種異系移植片拒絶の発生率と外来免疫抑制の必要性が減少することが記載されている（甲１ｂ）。

以上の記載からすると、甲１には、
「HLA適合組織移植のためのホモ接合型HLAを有する細胞ドナーから得られるiPSC」（甲１発明）
が記載されていると認められる。

イ．甲２の記載事項及び甲２に記載された発明
（ア）甲２の記載事項
甲２ａ
「同種ドナーからの万能細胞作製に向けたHLAクラスI発現の除去に向けて」（p1341、標題）

甲２ｂ
「この目的のために、我々はデザイナージンクフィンガーヌクレアーゼを開発し、HLAの発現を選択的に除去するための遺伝子編集の「ヒットアンドラン」アプローチを採用した。これらの設計されたヌクレアーゼをコードするmRNA種を電気的に導入すると、CD19特異的T細胞を含むヒトT細胞のHLA-A発現が完全に阻害された。…さらに、ジンクフィンガーヌクレアーゼが胚性幹細胞からHLA-Aの発現を除去できることを示し、この戦略の適用範囲がHLAが異なる免疫細胞の注入以外にも拡大された。これらの発見は、HLAの発現が異なるドナーから得られた臨床的に魅力的な細胞タイプが、免疫反応を回避するように遺伝子編集できることを立証し、1人のドナーから得られた細胞を複数のレシピエントに投与できる基盤を提供するものである。」 （p1341、冒頭概要5-15行）

甲２ｃ
「HLA-Aｎｅｇ HEK293の単離と機能検証
HLA-A発現を破壊する効果を評価するために、ZFN修飾HEK293プールから単細胞クローンを得るために限界希釈を使用した。配列決定により、HLA-A2、HLA-A3、または両アレルにおいて予想されるZFN結合部位内に挿入または欠失（indel）を有するクローンが発見され（補足図2）、これは翻訳の早期終了をもたらすフレームシフトにつながった。HEK293におけるHLA-Aの定常発現量はEBV-LCLのような造血細胞と比較して低いため、HLAレベルを増強することが知られている炎症性サイトカインにHEK293細胞を暴露した。IFN-γとTNF-αを添加すると親HEK293細胞では両方のHLA-Aアレルの発現が増加した（図2A、上）。一方、HLA-A2および/またはHLA-A3に変異を有するZFN処理した単細胞由来のHEK293クローンは、IFN-γおよびTNF-αによる誘導後でもこれらのタンパク質を発現しなかった（図2A、下3パネル）。次に、ZFN修飾クローン上のHLA-A発現の喪失が、HLA-A3およびHLA-A2制限CTLによる挑戦によってT細胞認識を妨げるかどうかを検討した。予想通り、HLA-A3制限CTLクローン7A7は、同族ペプチドの連続希釈物を負荷したHLA-A3+親HEK293株の強固な特異的溶解を示した（図2B、上）。HLA-A2対立遺伝子の発現を失ったがHLA-A3では野生型であるクローン8.18も、このHLA-A3制限CTLによって溶解させられた。一方、同じペプチドでパルスした場合、HLA-A3発現をなくすように編集したクローン18.1および83は、HLA-A3制限CTLクローン7A7によって溶解されなかった（図2B、上）。また、HLA-A2制限CTLクローンGAS2B3-5の細胞溶解活性を評価したところ、親HEK293またはHLA-A2野生型クローン18.1と提示すると強固な殺傷活性が観察されたが、ZFN-修飾 HLA-A2ｎｅｇ クローン 8.18 と HLA-A2/A3 ダブルノックアウトクローン 83 は溶解から免れた（図2B、下段）。これらのデータは、ZFNによる処理がHLA-Aの発現を完全に除去し、内因性HLA-A発現をアップレギュレートすることが知られている炎症性条件下でさえ、HLA-A制限CTL媒介殺傷からの保護をもたらすことを実証している。」 （p1343、右欄7行〜p1344、右欄23行）

甲２ｄ
「プライマリーT細胞におけるHLA-Aの破壊
我々の結果を臨床的に適切な初代細胞に拡張するために、我々はヒトT細胞におけるHLA-A特異的ZFNの活性を評価した。ZFNは目的の標的遺伝子を安定的に破壊するために短期間の発現しか必要としないため、in vitroで転写したmRNAからZFNを一過性に発現させた。HLA-A2ホモ接合体ドナー（HLA-A2は白人に最も多いHLA-A対立遺伝子）からのT細胞にZFNをコードするmRNAを電気移入すると、これらのT細胞の約19％がHLA-A2陰性になった（図3A、上）。我々は以前、トランスフェクション後にインキュベーション温度を一時的に下げるとZFN活性が高まることを示した。エレクトロポレーションしたT細胞を一時的な低体温にすると、mRNA用量依存的にHLA-A2陰性細胞の割合が最大57%まで高まった(図3A、下)。HLA-A2の機能的除去は、HLA-A2導入721.221細胞を汎クラスI抗体でプロービングすることでさらに確認された（補足図3）。」 （p1344、右欄24〜39行）

甲２ｅ
「ZFN処理は、選択なしにCAR+ T細胞のHLA-A2発現を破壊することに成功し、この集団は、HLA陽性細胞の陰性選択によって約99%のHLA-A2ｎｅｇ細胞まで容易に濃縮された(図5A)。CD19+ aAPC上で50日間連続共培養した後、CAR+T細胞の約94%がHLA-A2ｎｅｇを維持したことから、これらの細胞は、この新しい表現型を維持することが示された(データは示されていない)。重要なことは、CD19+腫瘍ターゲットのCAR依存的溶解によって証明されるように、これらのHLA-A2ｎｅｇ T細胞はHLA-A2拘束性 CTLによる攻撃を回避し（図5B）、抗腫瘍活性を維持した（図5C-D）」 （p1345、右欄2〜11行）

甲２ｆ
「hESCにおけるHLA-Aの破壊
組織再生などの治療用途に同種細胞の適用を広げるため、T細胞認識を回避できるhESCを作製することを目指した。 HLA-A2+/A24+のhESC株WIBR3を、HLA-Aを標的とするZFNをコードするmRNAまたはDNAプラスミドで遺伝的に修飾し、HLA-AｎｅｇhESCの生成にZFNを使用することを検討した。HLA-AｎｅｇhESCの生成を促進するため、ZFN標的部位を囲む相同領域の脇にピューロマイシン耐性遺伝子をコードするドナーDNAプラスミドを配し、相同性指向性修復による標的統合を媒介した（補足図4）。ピューロマイシン耐性クローンを、ZFN標的領域のPCR配列決定およびドナー相同性群の外側に位置するプローブを用いた標的領域のサザンブロット分析によって、HLA-A対立遺伝子の改変についてスクリーニングした。両方のHLA-AアレルのZFN標的領域に変異を含むこれらのクローンを線維芽細胞様細胞に分化させ、同様に分化した未修飾の親hESCラインと比較した。HLAの発現はIFN-γおよびTNF-αで処理することで誘導し、フローサイトメトリーで解析した。親細胞株は両方のHLA-Aアレルの強い発現を示したが、3つのノックアウト株はすべて、両方のHLA-Aアレルの細胞表面発現を欠いていた（図6）。これらのデータは、HLA-Aノックアウト法がhESCに適用可能であることを示しており、適用後のこれらの細胞とその子孫の存続に必要なステップである可能性がある。」（p1345、右欄12〜38行）

甲２ｇ
「しかしhESCは本質的にレシピエントに対して同種であるが、その移植は由来する細胞や組織に異なるHLAが発現しているため、複雑になる。我々はこの問題の解決策を示した：すなわち、ZFNを用いることで、細胞表面から特定のHLA分子の発現を永久的に除去し、これらのエピトープに対する免疫認識を防ぐことである。iPSCから派生した細胞のT細胞媒介性拒絶反応は、HLA関連の免疫原性抗原の提示により生じるので、自己由来の人工多能性細胞（iPSC）であってもこのアプローチは有益である。」 （p1347、右欄1〜10行）

（イ）甲２に記載された発明（甲２発明）の認定
甲２には、「HLA-A2+/A24+のhESC株WIBR3を、HLA-Aを標的とするZFNをコードするmRNAまたはDNAプラスミドで遺伝的に修飾し、HLA-AｎｅｇhESC」を生成したこと（甲２ｆ）、「ノックアウト株はすべて、両方のHLA-Aアレルの細胞表面発現を欠いていた」ことが記載されている（甲２ｆ）。

以上の記載からすると、甲２には、
「両方のHLA-Aアレルの細胞表面発現を欠いているHLA-A2+/A24+のhESC株WIBR3より得られるHLA-AｎｅｇhESC」（甲２発明）が記載されていると認められる。

ウ．甲５の記載事項及び甲５に記載された発明
（ア）甲５の記載事項
甲５ａ
「実施例９ HLAホモ健常人由来歯髄幹細胞からのiPS細胞の樹立
HLA-A、HLA-B、HLA-CwおよびHLA-DRB1の4遺伝子座がホモの健常人由来の歯髄幹細胞（DP74株およびDP94株）は、岐阜大学、國貞隆弘博士、手塚健一博士より提供を受けた。・・・pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hULをDP74およびDP94に導入して樹立したiPS細胞の写真を図１５に示す。」 （０１１７−０１１９段落）

甲５ｂ
「体細胞を採取するソースとなる哺乳動物個体は特に制限されないが、得られるiPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人またはHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から体細胞を採取することが好ましい。ここでHLAの型が『実質的に同一』とは、免疫抑制剤などの使用により、該体細胞由来のiPS細胞から分化誘導することにより得られた細胞を患者に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にHLAの型が一致していることをいう。たとえば主たるHLA（例えばHLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座、さらにHLA-Cwを含む4遺伝子座）が同一である場合などが挙げられる（以下同じ）。」（００２２段落）

甲５ｃ
「したがって、患者本人やHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導すれば、そこから所望の細胞（即ち、該患者が罹病している臓器の細胞や疾患に対する治療効果を発揮する細胞など）に分化させて該患者に移植するという、自家もしくは同種異系移植による幹細胞療法が可能となる。」（０１０１段落）

（イ）甲５に記載された発明（甲５発明）の認定
甲５には、「pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hULを」「HLA-A、HLA-B、HLA-CwおよびHLA-DRB1の4遺伝子座がホモの健常人由来の歯髄幹細胞（DP74株およびDP94株）」に導入して樹立したiPS細胞が記載されている（甲５ａ）。

以上の記載から、甲５には、
「HLA-A、HLA-B、HLA-CwおよびHLA-DRB1の4遺伝子座がホモの健常人由来の歯髄幹細胞（DP74株およびDP94株）より得られるiPS細胞」（甲５発明）が記載されていると認められる。

エ．甲３の記載事項
甲３ａ
「もし、ドナーの造血幹細胞を編集してHLA-A遺伝子座の発現を排除できれば、利用可能なドナープールは著しく増加するだろう。実際、NMDPのモデリングでは、アフリカ系アメリカ人のレシピエントがHLA-A、B、C、DRではなく、HLA-B、C、DRで適合すればよいなら、HLA適合ドナーを見つける確率は18%から73%に増加することが示されている。我々は、遺伝子操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）により、遺伝子編集T細胞においてHLA-Aの発現を破壊できることを以前に示した（Blood 2013）。この概念実証を造血幹細胞に拡張するために、この遺伝子座を標的とするZFNを導入してHLA-A発現を破壊することを試みた。」 （2頁目 1-7行）

オ．甲４の記載事項
甲４ａ
「そのため、臨床使用に必要な細胞株の数を管理可能なレベルまで減らすために、複数の同種のレシピエントと互換性のある多能性幹細胞株を開発することが真に必要とされている。ここでは、この問題に対処するため、2つの遺伝子工学的アプローチを開発した。まず、HLA-ヘテロ接合性のESC株からHLA-ホモ接合性のサブクローンを得る方法を記載する。１つのハプロタイプにのみ適合すればよいため、１つのHLA-ホモ接合株が多数のレシピエントに適合しうる。2つ目の方法は、B2M遺伝子を破壊することで、細胞表面にクラスIタンパク質を発現しないHLA陰性の幹細胞を開発する方法である。このB2M-/-ESCは、移植される細胞がHLAクラスII遺伝子を発現しない場合に、ユニバーサルドナー細胞として機能し得る。」 （p1233左欄、第2段落）

甲４ｂ
「iPS細胞は治療効果においてESCと同一ではないかもしれないが、より現実的な代替案は、HLAホモ接合体の個体からiPSCのバンクを導出することだろう。 iPSCが臨床的に使用される場合、我々の方法は、1つのHLAハプロタイプを共有する患者の家族から組織適合性のHLAホモ接合性iPSCを導出することを可能にし、遺伝病の治療に適合した遺伝的に正常な細胞のソースを提供する。」 （p1238左欄、第2段落16-最終行）


３．申立理由１〜３（進歩性）の検討
（１）本件発明８と甲１発明の対比、判断
ア．本件発明８と甲１発明の対比
本件発明８と甲１発明（２．ア．（イ））を対比する。
甲１発明の「ホモ接合型HLA」は、本件発明１の「少なくとも１つのセットのホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子」に相当する。
甲１発明の「HLA適合組織移植のための」「iPSC」は、ヒト患者に向けたものであることが明らかであるから、本件発明８の「哺乳動物人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」に相当する。

そうすると、本件発明８と甲１発明は、
「少なくとも１つのセットのホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子を含む、哺乳動物人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」で一致し、以下の点で相違している。

＜相違点１＞
本件発明１では、「ＨＬＡ−Ａｎｅｇ表現型を含む」ことが規定されているのに対し、
甲１発明では、上記のような規定がなされていない点

イ．相違点１の判断
甲１は、「既知のドナーおよびレシピエントのHLA型に基づくHLA適合組織移植用iPS細胞バンクの作製」と題する論文であり（甲１ａ）、ヒト白血球抗原（HLA）不一致の人工多能性幹細胞（iPSC）は、免疫学的拒絶反応を起こす可能性が高く、治療の可能性が制限されるという課題（甲１ａ）に対して、「理論的HLAの組み合わせのうち236通り（58.3%）のHLAホモ接合体潜在的iPSCドナー」により課題を解決しようとするものである（甲１ｃ）。
しかし、甲１には、HLAホモ接合体を使用する手段に他の解決手段を付加することが上記の課題の解決に必要であることは記載されていないし、そもそもＨＬＡが存在していることに伴う問題についても全く認識されていない。
一方、甲２には、組織再生などで同種細胞の適用を広げることを目的として（甲２ｆ）、ZFNによりHLA-A遺伝子を両アレルで破壊してヒトHLA-Aｎｅｇ細胞を調製すること（p1343右欄、p1344右欄、p1345右欄）が記載され（甲２ｃ〜ｆ）、このHLA除去はiPSCにも適用できることが記載されており（甲２ｇ）、甲３には、HLA-Aｎｅｇ造血幹細胞の作製に関し、HLA-A遺伝子座の発現を除去できれば、利用可能なドナープールは著しく増加することが記載されている（甲３ａ）。
しかし、甲２、３に記載されているHLA-A遺伝子座の発現を除去する手段を、他の同種細胞の適用を広げる手段と併用すべきことを当業者に動機付ける記載や示唆は甲２、３に存在しない。
そうすると、ＨＬＡをホモで存在させることを前提とする甲１発明に、甲２、３に記載されているHLA-A遺伝子座の発現を除去する手段を適用することが当業者に動機付けられるということはできない。
また、申立人が副引例として提示した甲４、甲５には、HLA-A遺伝子座の発現を除去することについて記載も示唆もされていない。
そうすると、相違点１として挙げた本件発明８の発明特定事項は、甲２〜甲５の記載事項を勘案しても、当業者が容易に想到し得たものとはいえない。

ウ．小括
以上のとおり、本件発明１は、甲１発明、すなわち、甲１に記載された発明に甲２〜甲５の記載事項を組み合わせても当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。

（２）本件発明８と甲２発明の対比、判断
ア．本件発明８と甲２発明の対比
本件発明８と甲２発明（２．イ．（イ））を対比する。
甲２発明の「両方のHLA-Aアレルの細胞表面発現を欠いている」、「HLA-Aｎｅｇ」は、本件発明１の「ＨＬＡ−Ａｎｅｇ表現型を含む」に相当する。
甲２発明の「hESC」は、ヒト由来の多能性幹細胞である胚性幹細胞を意味することが明らかであるから、本件発明８の「哺乳動物人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」とは、哺乳動物多能性幹細胞である限りにおいて一致する。

そうすると、本件発明８と甲２発明は、
「ＨＬＡ−Ａｎｅｇ表現型を含む、哺乳動物多能性幹細胞」で一致し、以下の点で相違している。

＜相違点２＞
本件発明８では、「少なくとも１つのセットのホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子」を含むと規定されているのに対し、 甲２発明では、上記のような規定がなされていない点

＜相違点３＞
本件発明８では、哺乳動物多能性幹細胞が「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」であることが規定されているのに対し、 甲２発明では、哺乳動物多能性幹細胞が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）である点

イ．相違点２の判断
甲２は、「同種ドナーからの万能細胞作製に向けたHLAクラスI発現の除去に向けて」と題する論文であり（甲２ａ）、免疫介在性拒絶反応を回避するという課題に対して、「HLA発現の選択的除去」（要約）すなわち、ヒトHLA-Aneg細胞を調製する（甲２ｆ）という手段を採用することで上記の課題を解決しようとするものである（甲２ｂ）。
しかし、甲２には、ヒトHLA-Aneg細胞を調製するという手段に、他の解決手段を付加することが上記の課題の解決に必要であることは記載されていないし、そもそもHLAの適合率を上げるという課題についても全く認識されていない。
一方、甲１、甲４及び甲５には、「少なくとも１つのセットのホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子」を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が開示されているといえる（甲１ｂ、甲１ｃ、甲４ｂ、甲５ａ）。
しかし、甲１、甲４及び甲５に記載されているホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子を用いるという手段を、他のHLA適合組織移植（甲１ａ）のための手段と併用すべきことを当業者に動機付ける記載や示唆は、甲１、甲４及び甲５に存在しないから、ＨＬＡを除去することを前提とする甲２発明に、甲１、甲４及び甲５に記載されているホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子を用いるという手段を適用することが当業者に動機付けられるということはできない。
また、申立人が副引例として提示した、甲３には、ホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子を用いることについて記載も示唆もされていない。
そうすると、相違点２として挙げた本件発明８の発明特定事項は、甲１、甲３〜甲５の記載事項を勘案しても、当業者が容易に想到し得たものとはいえない。

ウ．小括
以上のとおり、本件発明８は、相違点３について検討するまでもなく、甲２発明、すなわち、甲２に記載された発明に甲１、甲３〜甲５の記載事項を組み合わせても当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。

（３）本件発明８と甲５発明の対比、判断
ア．本件発明８と甲５発明の対比
本件発明８と甲５発明（２．ウ．（イ））を対比する。
甲５発明の「HLA-A、HLA-B、HLA-CwおよびHLA-DRB1の4遺伝子座がホモ」は、本件発明１の「少なくとも１つのセットのホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子」に相当する。
甲５発明の「ヒト由来iPS細胞」は、本件発明８の「哺乳動物人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」に相当する。

そうすると、本件発明８と甲１発明は、
「少なくとも１つのセットのホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子を含む、哺乳動物人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）。」で一致し、以下の点で相違している。

＜相違点４＞
本件発明８では、「ＨＬＡ−Ａｎｅｇ表現型を含む」ことが規定されているのに対し、
甲５発明では、上記のような規定がなされていない点

イ．相違点４の判断
甲５には、「得られるiPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人またはHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から体細胞を採取することが好ましい。ここでHLAの型が「実質的に同一」とは、免疫抑制剤などの使用により、該体細胞由来のiPS細胞から分化誘導することにより得られた細胞を患者に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にHLAの型が一致していることをいう。たとえば主たるHLA（例えばHLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座、さらにHLA-Cwを含む4遺伝子座）が同一である場合などが挙げられる」と記載されている（甲５ｂ）。
しかし、甲５には、HLAの型を一致させるという手段に他の解決手段を付加することが、拒絶反応を起こさないという観点で必要であることは記載されていないし、そもそもＨＬＡが存在していることに伴う問題についても全く認識されていない。
一方、甲２には、組織再生などで同種細胞の適用を広げることを目的として（甲２ｆ）、ZFNによりHLA-A遺伝子を両アレルで破壊したヒトHLA-Aｎｅｇ細胞を調製すること（p1343, 右欄、p1344右欄、p1345右欄）が記載され（甲２ｃ〜ｆ）、このHLA除去はiPSCにも適用できることが記載されており（甲２ｇ）、甲３には、HLA-Aｎｅｇ造血幹細胞の作製に関し、HLA-A遺伝子座の発現を除去できれば、利用可能なドナープールは著しく増加することが記載されている（甲３ａ）。
しかし、甲２、３に記載されているHLA-A遺伝子座の発現を除去する手段を、他の同種細胞の適用を広げる手段と併用すべきことを当業者に動機付ける記載や示唆は甲２、３に存在しない。
そうすると、ＨＬＡをホモで存在させることを前提とする甲５発明に、甲２、３に記載されているHLA-A遺伝子座の発現を除去する手段を適用することが当業者に動機付けられるということはできない。
また、申立人が副引例として提示した甲１、甲４には、HLA-A遺伝子座の発現を除去することについて記載も示唆もされていない。
そうすると、相違点４として挙げた本件発明８の発明特定事項は、甲１〜甲４の記載事項を勘案しても、当業者が容易に想到し得たものとはいえない。

ウ．小括
以上のとおり、本件発明８は、甲５発明、すなわち、甲５に記載された発明に甲１〜甲４の記載事項を組み合わせても当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。

（４）本件発明９〜１１について
本件発明９〜１１は、本件発明８を直接又は間接的に引用するものであるから、本件発明８と同様の理由により、甲１、甲２，甲５に記載された発明に、それぞれ甲１〜甲５の記載事項を組み合わせても当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。


４．申立理由４（実施可能要件）の検討
（１）実施可能要件の考え方
発明の詳細な説明の記載が実施可能要件に適合するというためには、明細書の発明の詳細な説明に、当業者が、明細書の発明の詳細な説明の記載及び出願時の技術常識に基づいて、過度の試行錯誤を要することなく、その発明を実施することができる程度に発明の構成等の記載があることを要する。

（２）本件発明８の実施可能要件の判断
本件明細書の【０２０１】〜【０２０９】には、造血幹細胞（ＨＳＣ）への遺伝子編集を拡張するために、ＨＬＡ−Ａの遺伝子座を標的とするＺＦＮを導入することによって、ＨＬＡ−Ａ発現を崩壊させたこと、ＨＬＡホモ接合ＵＣＢ（表２）に由来するＴ細胞に、初期化因子を含むベクターを感染させてｉＰＳコロニーを出現させたこと、多能性細胞様の形態を維持し、ｉＰＳＣによる多能性マーカーの発現を確認したこと、ジンクフィンガーヌクレアーゼによるＴＲＡＣ遺伝子を崩壊させ、崩壊したＴＲＡＣ遺伝子を有するクローンを同定するために、ゲノムＤＮＡ配列決定によって分析したことが記載されている（本ｃ）。
本件明細書には、ｉＰＳＣのＨＬＡ−Ａ発現をＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）により崩壊させた具体例は記載されていないものの、ＺＦＮによりｉＰＳＣの標的遺伝子（ＴＲＡＣ遺伝子）を崩壊させることは具体的に記載されているし、造血幹細胞（ＨＳＣ）についてであるが、ＺＦＮによりＨＬＡ−Ａの遺伝子座を標的とする遺伝子編集を行ったことも具体的に記載されているので、ｉＰＳＣのＨＬＡ−Ａの遺伝子編集を行うことに過度の試行錯誤を要するとはいえない。
また、ＨＬＡホモ接合ＵＣＢ（表２）において、HLA-A、HLA-B、HLA-C、及びHLA-DRB1がすべてホモ接合のもの（CB-ID3213、CBID-3233、CBID-9855）だけでなく、HLA-Cがヘテロのもの（CBID-23707）も提供されていたように（本ｃ）、HLA-A、HLA-B、HLA-C、及びHLA-DRB1がすべてホモ接合ではないHLA-Aホモ接合の細胞が本件出願当時入手困難であった等の特段の事情を見出すことはできない。
よって、本件明細書の発明の詳細な説明には、当業者が、過度の試行錯誤を要することなく、本件発明８を実施することができる程度に発明の構成等が記載されているというべきである。

（３）申立人の主張について
申立人は、本件特許には、「少なくとも１つのセットのホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子」を含み、かつHLA-AｎｅｇであるiPSCの作製は何ら示されていないから、発明の詳細な説明には、本件発明が実施可能な程度に開示されているとは言えないと主張している。
しかし、本件明細書の【０２０１】〜【０２０９】には、上述のとおりの記載があり（本ｃ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）に対して用いたＨＬＡ−Ａの遺伝子座を標的とするＺＦＮを導入した場合に、ｉＰＳＣのＨＬＡ−Ａの遺伝子編集が過度の試行錯誤を要する等の特段の事情を見出すことはできず、その他HLA-AｎｅｇであるiPSCの作製を行えないことを示す客観的資料（本件特許の出願時の技術常識等）は、申立人より何ら提示されていない。
したがって、上記の申立人の主張は、いずれも理由がない。

（４）小括
以上のとおり、請求項８の記載は実施可能要件を満たすものであるから、請求項８を直接又は間接的に引用する請求項９〜１１の記載も、同様の理由により、実施可能要件を満たすものである
したがって、申立理由４（実施可能要件）は、理由がない。

５．申立理由５（サポート要件）の検討
（１）サポート要件の考え方
特許請求の範囲の記載が明細書のサポート要件に適合するか否かは、特許請求の範囲の記載と発明の詳細な説明の記載とを対比し、特許請求の範囲に記載された発明が、発明の詳細な説明に記載された発明で、発明の詳細な説明の記載又はその示唆により当業者が当該発明の課題を解決できると認識できる範囲のものであるか否か、また、その記載や示唆がなくとも当業者が出願時の技術常識に照らし当該発明の課題を解決できると認識できる範囲のものであるか否かを検討して判断すべきものである。

（２）本件発明が解決しようとする課題
本件発明８〜１１の記載及び本件明細書の【０００６】の記載によると、本件発明は、同種異系の免疫細胞媒介性拒絶反応を回避し、患者からの細胞培養物を増やす必要なく患者に注入することができる細胞製品を提供することにあると認められる（本ａ）。

（３）本件発明８のサポート要件の判断
本件明細書の【００４２】には、「特定の態様では、実施形態の細胞は、ＨＬＡ対立遺伝子の１つまたは複数のペアにホモ接合性であり、ＨＬＡ−Ａｎｅｇ表現型を含む。これらの特徴によって、前記細胞を多数の患者にとって有効な免疫適合性のある細胞にし、それによって個別の患者のために開発された治療法よりはるかに低コストで生み出すことができる細胞ベースの治療法を提供する。」と記載され（本ｂ）、 他方、【０２０２】には、「必要なドナーの数を最小化する一つの方法として、ＨＬＡ−ホモ接合ドナーから１つのＨＬＡ遺伝子座を削除してもよい。ドナー細胞からのＨＬＡ−Ａ除去が適切なＨＬＡ適合ドナーを見つける確率（図１）に有意な影響を有し得ることが判明した。したがって、ＨＬＡホモ接合ドナーからＨＬＡ−Ａ発現を排除することによって、ＨＬＡ適合患者に注入することができるバンクされたｉＰＳＣの必要数が減少する」ことが記載されている（本ｃ）。
以上の記載からすると、本件発明８において、少なくとも１つのセットのホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子という手段とＨＬＡ−Ａｎｅｇ表現型という手段を併用すれば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ細胞）を、多数の患者にとって有効な免疫適合性のある細胞にできるとともに、ＨＬＡ適合患者に注入できるバンクされたｉＰＳＣの必要数も減少できることが当業者に理解できるといえる。
そうすると、本件明細書には、「少なくとも１つのセットのホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子」を含み、「HLA-Aneg」であるiPSCの効果も示されているといえ、本件発明８は、当業者が、本件明細書の発明の詳細な説明の記載により、上記（２）の課題を解決できると認識できる範囲のものであると認められる。

（４）申立人の主張について
申立人は、本件特許発明の課題は、HLA-Aの発現を除去し、かつ、HLAをホモ接合とすることで、より多くの患者に免疫学的適合性を有する細胞を提供することにあり、当業者であっても、発明の詳細な説明の記載からは、HLA-Aｎｅｇで、かつ、HLA-B、HLA-C、及びHLA-DRB1がすべてホモ接合である場合以外において、上記課題が解決されることは理解できない旨を主張する。
しかし、本件明細書の記載からは、HLA-B、HLA-C、及びHLA-DRB1がすべてホモ接合である場合以外においても、バンクされたｉＰＳＣの必要数を一定程度減少できることは理解できるし、ｉＰＳＣの必要数の減少に、HLA-B、HLA-C、及びHLA-DRB1がすべてホモ接合であることが不可欠であることを示す客観的資料（本件特許の出願時の技術常識等）も申立人より提示されてないから、本件発明が、上記（２）の課題を解決できない態様を明らかに含むものとは認められない。
よって、申立人の主張は、理由がない。

（５）小括
請求項８の記載はサポート要件を満たすものであるから、請求項８を直接又は間接的に引用する請求項９〜１１の記載も、同様の理由により、サポート要件を満たすものである。
したがって、申立理由５（サポート要件）は、理由がない。


第５ むすび
以上のとおり、本件特許に係る特許異議申立てにおいて申立人が主張する申立理由は、いずれも理由がないから、本件発明８〜１１に係る特許は、取り消すことができない。
ほかに、本件発明８〜１１に係る特許を取り消すべき理由も発見しない。

よって、結論のとおり決定する。
 
異議決定日 2022-06-23 
出願番号 P2016-563937
審決分類 P 1 652・ 537- Y (C12N)
P 1 652・ 121- Y (C12N)
P 1 652・ 536- Y (C12N)
最終処分 07   維持
特許庁審判長 福井 悟
特許庁審判官 上條 肇
吉森 晃
登録日 2021-08-24 
登録番号 6933898
権利者 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム
発明の名称 養子細胞治療製品を製造するための誘導多能性幹細胞の適用  
代理人 森下 夏樹  
代理人 山本 秀策  

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